NADP苹果酸酶(NADP-ME)活性检测试剂盒 微板法

产品简介：

苹果酸酶是生物体内重要的酶之一，广泛存在于动物、植物、细菌体中。是苹果酸代谢的关键酶。近年来植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。该酶发挥作用需要 辅酶因子的参与,依据辅酶因子的不同,分为NADP-ME(EC1.1.1.40)和NAD-ME(EC1.1.1.38)。  

ME的主要功能是催化苹果酸氧化脱羧产生丙酮酸和CO₂,以及伴随NADP+的还原反 应,NADP-ME催化NADP+还原成 NADPH，本试剂盒通过检测NADPH在340nm处的增加速率即可得出NADP-ME的酶活性大小。

保存条件: 

-20℃保存，三个月有效。

产品组成：

产品使用：

建议正式实验前，选取2个样本做预测定，了解实验样品情况，熟悉流程，避免样本和试剂浪费！

一、样本准备

1. 组织样本：

(a) 称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；

(b) 12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量,可按组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例提取

2. 细菌/细胞样本：

(a) 先收集细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清；

(b) 取5×10⁶个细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细胞或细菌（冰浴，功率200w，超 声3s，间隔10s，重复30次）；

(c) 12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按每0.5~1×10⁷个细菌数量加入1mL提取液的比例进行提取。

3. 液体样本：

直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。

二、样品测定

1. 酶标仪预热30min，设定波长到340nm。

2. 所有试剂在25℃水浴中孵育10min。

3. 在96孔板中依次加入：

【注】：若ΔA过小，可以延长反应时间T(如:10min 或更长)，或增加样本上样量 V1(如增至20uL，则试剂二相应减少)，重新调整的T或V1需代入计算公式重新计算。

三、结果计算

1. 按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：25℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟生成1nmolNADH定义为一个酶活单位。

NADP-ME(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(V1×Cpr)÷T=2143.6×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算：

酶活定义：25℃条件下，每克组织蛋白每分钟生成1nmolNADH定义为一个酶活单位。

NADP-ME(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V1÷V)÷T=2143.6×ΔA÷W

3. 按细菌/细胞密度计算：

酶活定义：25℃条件下，每10⁴个细菌/细胞每分钟生成1nmolNADH定义为一个酶活单位。

NADP-ME(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V1÷V)÷T=4.29×ΔA

4. 按液体体积计算：

酶活定义：25℃条件下，每毫升液体每分钟生成1nmolNADH定义为一个酶活力单位。

 NADP-ME(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷V1÷T=2143.6×ΔA

V--提取液体积，1mL

V1--加入样本体积，0.01mL

V2--反应体系总体积，2×10^-4L

d--光径，0.5cm

ε--NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm

W--样本质量，g

500--细胞数量，万

T--反应时间，3min

Cpr--蛋白浓度（mg/mL）

注意事项：

1.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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