NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)活性检测试剂盒

(线粒体和胞质) 分光法

产品简介：

苹果酸脱氢酶广泛存在于动植物、微生物和培养细胞中，依据需要的辅酶不同，可分为： NAD-MDH和NADP-MDH，前者主要存在于线粒体和胞质中，后者存在于某些微生物和植物叶绿体中；苹果酸脱氢酶与多条生理代谢途径密切相关：线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨 酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。

NAD-MDH（EC1.1.1.37）催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，使NADH在340nm处 光吸收下降，进而通过340nm处光吸收的下降速率计算得到NAD-MDH的酶活性大小。

保存条件: 

-20℃保存，三个月有效。

产品组成：

产品使用：

建议正式实验前，选取 2 个样本做预测定，了解实验样品情况，熟悉流程，避免样本和 试剂浪费。

一、样本准备

1. 组织样本：

(a) 称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。

(b) 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例进行提取。

2. 细胞/细菌样本：

(a) 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；

(b) 取5×10⁶个细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超 声3s，间隔10s，重复30次）；

(c) 12000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，按照每0.5~1×10⁷个细菌/细胞加入1mL提取液进行提取。

3. 液体样本：

直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。

二、样品测定

1. 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 测定前将溶好的试剂一在25℃水浴锅中孵育10min以上。

3. 在1mL石英比色皿（光径1cm）中依次加入：

【注】1 若ΔA在零附近，可延长反应时间T（如增至10min）读取A2；或加大样本量V1（如增至80μL，则试剂二相应减少）。改变后的反应时间T或V1需代入公式重新计算。

2 若ΔA大于0.6或A2的值小于0.5，需缩短反应时间时间T（如减至0.5min），或减少样本量V1（如 减至10μL，则试剂二相应增加），则改变后的T和V1需代入公式重新计算。

3 若起始值A1太大如超过2（颜色较深的植物叶片，一般色素较高则起始值相对会偏高），可减少 V1（如减至10μL，则试剂二相应增加），则改变后的V1代入公式重新计算。或向待测样本中加少许活性炭混匀静置5min后12000rpm,4℃离心10min，上清液用于检测；

4 若下降趋势不稳定，可以每隔10S读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的A值也代入公式重新计算。

三、结果计算

1. 按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T

=3215.4×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算：

酶活定义：每克组织中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V1÷V)÷T =3215.4×ΔA÷W

3. 按细菌/细胞密度计算：

酶活定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V1÷V)÷T=6.43×ΔA

4. 按液体体积计算：

酶活定义：每毫升液体每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NAD-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷V1÷T=3215.4×ΔA

ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm

d---96 孔板光径，1cm

V---加入提取液体积，1mL

V1---加入样本体积，0.04mL

V2---反应体系总体积，8×10^-4L

T---反应时间，1min

500---细胞或细菌总数，万

W---样本质量，g

Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL

注意事项：

1.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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