NADH氧化酶(NOX)活性检测试剂盒 分光法

产品简介：

NADH氧化酶（NOX，EC1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生，而且与免疫反应密切相关。

NOX能够将NADH氧化为NAD，通过检测NADH于340nm处的下降速率，即可得出NADH氧化酶活性的大小。

保存条件: 

-20℃保存，3个月有效。

产品组成：

产品使用：

建议正式实验前，选取2个样本做预测定，了解实验样品情况，熟悉流程，避免样本和试 剂浪费！

一、线粒体制备（提示：整个线粒体的提取过程须保持4℃低温环境）

1. 称取约0.2g组织或收集1000万细菌/细胞，加入1mL试剂一，用冰浴匀浆器或研钵冰浴匀浆，转移至离心管后于4℃×3000g离心20min；

2. 小心吸取上清液（弃沉淀）移至另一离心管中，4℃×16000g离心20min。用移液器移除上清液（上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的NOX（此步可选做））。 留下沉淀（沉淀即为线粒体）。

3. 在沉淀（线粒体）中加入200μL试剂二，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声5s，间隔3s，重复30次），液体置于冰上用于线粒体NOX酶活性测定。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取，或按照细菌/细胞数量（10⁴）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。

二、样品测定

1. 紫外分光光度计预热30min以上，设定温度25℃，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 所有试剂解冻至室温（25℃）。

3. 在1mL石英比色皿（光径1cm）中依次加入：

【注】若△A小于0.01，可以延长反应时间T（如至10min或更长），则改变后的反应时间T需代入公式重新计算。

三、含量计算

1. 按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟氧化1nmolNADH定义为一个酶活单位。

NOX(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×10⁹]÷(V1×Cpr)÷T=396.6×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算：

酶活定义：每克组织每分钟氧化1nmolNADH定义为一个酶活单位。

NOX(nmol/min/g鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×10⁹]÷(W×V1÷V)÷T=79.3×ΔA÷W

3. 按细菌或细胞密度计算：

酶活定义：每1万个细菌或细胞每分钟氧化1nmolNADH定义为一个酶活力单位。

NOX(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×10⁹]÷(500×V1÷V)÷T=0.16×ΔA

ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm

d---1cm

V---加入试剂二的体积，0.2mL

V1---加入样本体积，0.06mL

V2---反应体系总体积，7.4×10^-4L

T---反应时间，5min

W---样本质量，g

500---细胞或细菌总数，万

Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL

注意事项：

1.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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