NADH-谷氨酸脱氢酶(NADH-GDH)活性检测试剂盒 分光法

产品简介：

谷氨酸脱氢酶广泛分布于生物体中，在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。其辅酶是NADH或NADPH，在动植物种两种辅酶都有存在，而以NADH-谷氨酸脱氢酶（EC 1.4.1.2）活力为主。

本试剂盒提供一种快速灵敏的检测方法，样品中的NADH-谷氨酸脱氢酶特异性作用于底物谷氨酸并产生NADH，同时与显色剂反应生成黄色物质，该物质在450nm处有最大吸收峰，进而得到NADH-GDH的酶活性大小。

保存条件: 

2-8℃保存，三个月有效。

产品组成：

【注】：粉剂量在mg级别，使用前用手甩几次或者进行离心，打开直接加入要求的试剂即可。

产品使用：

一、样本准备

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1. 组织样本：

(a) 称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；

(b) 12000rpm 4℃离心 10min，取上清液，置冰上待测。

2. 细胞/细菌样本：

(a) 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；

(b) 取5×10⁶个细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；

(c) 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，按照每0.5~1×10⁷个细菌/细胞加入1mL提取液进行提取。

3. 液体样本：

直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。

二、样品测定

1. 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

2. 在1mL玻璃比色皿（光径1cm）中依次加入：

【注】：

1. 若ΔA值小于0.01，可以延长反应时间T（如由15min增至30min或1小时），或增加加样体积V1如由160μL增至320μL，则提取液相应减少），则改变后的T和V1需要代入计算公式重新计算。

2. 若立即读值导致上升趋势不稳定，可加完所有试剂混匀后静置5min后再读取A1；也可选取一段线性上升的时间段来参与计算，相对应的A值也代入计算公式重新计算。

三、结果计算

1. 标准曲线：y=0.0338x-0.0434，x是NADH摩尔质量（nmol），y是ΔA。

2. 按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成1nmolNADH定义为一个酶活力单位。

 NADH-GDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0434)÷0.0338]÷(V1×Cpr)÷T =12.33×(ΔA+0.0434)÷Cpr

3. 按样本鲜重计算：

单位定义：每克组织每分钟生成1nmolNADH定义为一个酶活力单位。

 NADH-GDH(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0434)÷0.0338]÷(W×V1÷V)÷T =12.33×(ΔA+0.0434)÷W

4. 按细菌/细胞密度计算：

单位定义：每1万个细菌/细胞每分钟生成1nmolNADH定义为一个酶活力单位。

 NADH-GDH(nmol/min/10⁴ cell)=[(ΔA+0.0434)÷0.0338]÷(500×V1÷V) ÷T =0.025×(ΔA+0.0434)

5. 液体中NADH-GDH活力的计算：

单位定义：每毫升液体每分钟生成1nmolNADH定义为一个酶活力单位。

 NADH-GDH(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0434)÷0.0338]÷V1÷T=12.33×(ΔA+0.0434)

V---加入提取液体积，1mL

V1---加入样本体积，0.16mL

T---反应时间，15min

W---样本质量，g

500---细菌或细胞总数，500万

Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL

附：标准曲线制作过程：

1. 制备标准品母液（0.5nmol/μL）：向标准品离心管里面加入1.41ml蒸馏水（母液需在两天内用且-20℃保存）。

2. 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0，0.04，0.08，0.12，0.16，0.2.nmol/μL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。

3. 依据测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。

注意事项：

1.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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