辅酶Ⅰ NAD+/NADH含量测定试剂盒 微板法

产品简介：

烟酰胺核苷酸的测定一直是细胞或组织在能量转化和氧化还原状态方面的研究热点。 NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，其NAD+/NADH比值的高低不仅可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱，而且在生物物质合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

本试剂盒提供一种方便，快速的检测方法，提供特异性提取液分别提取样品中的NAD+和NADH，NADH在递氢体作用下与一种高灵敏度的显色剂反应生成黄色水溶性甲瓒，在 450nm下检测，得到NADH含量。利用乙醇脱氢酶特异性还原NAD+为NADH，从而检测NAD+含量。

保存条件: 

-20℃保存，三个月有效。

产品组成：

产品使用：

建议正式实验前，选取2个样本做预测定，了解实验样品情况，熟悉流程，避免样本和试剂浪费。

一、样本准备：

1. 组织样本准备：

(a) NAD+的提取：

取约0.1g组织（水分充足样本可取0.5g），加入1mL提取液A，冰浴研磨，全部转移到离心管中（用提取液A补齐到1mL），植物样本于95℃孵育5min或动物样本于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm4℃离心10min；取500μL上清液至新离心管中，再加V1体积的提取液B中和（可分次添加提取液B，调至PH约中性，记录提取液B加入体积为V1）；12000rpm，4℃离心5min，取上清液置于冰上待测。

(b) NADH的提取：

取约0.1g组织（水分充足样本可取0.5g），加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部转移到离心管中（用提取液B补齐到1mL），植物样本于95℃孵育5min或动物样本于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃离心10min；取500μL上清液至新离心管中，再加V2体积的提取液A中和（可分次添加提取液A，调至PH约中性，记录提取液A加入体积为V2）；12000rpm，4℃离心5min，取上清液置于冰上待测。

【注】：若测出值较低，可加大样本取样量，如增加到0.2g等，可做几个梯度选择适合本次实验的样本量。

2. 细菌/细胞样本准备：

(a) NAD+的提取：

先收集细胞或细菌到离心管内：取约5×10⁶个细菌或细胞加入1ml提取液A，冰浴研磨， 全部转移到离心管中（用提取液A补齐到1mL），于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或 放冰箱）5min；12000rpm 4℃离心10min；取500μL上清液至新离心管中，再加V1体积的提取液B中和（可分次添加提取液B，调至PH约中性，记录提取液B加入体积为V1）；12000rpm，4℃离心5min，取上清液置于冰上待测。

(b) NADH的提取：

先收集细胞或细菌到离心管内：取约5×10⁶个细菌或细胞加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部转移到离心管中（用提取液B补齐1mL），于60℃孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃离心10min；取500μL上清液至新离心管中，再加V2体积的提取液A中和（可分次添加提取液A，调至PH约中性，记录提取液A加入体积为V2）；12000rpm 4 ℃离心5min，取上清置于冰上待测。

【注】：若测出值较低，可加大样本取样量，如增至1×10⁷个等，可做几个梯度选适合本次实验的样本量。

3. 液体样本准备：

(a) NAD+的提取：

在离心管中加入约0.1mL液体样本，然后再加入1mL提取液A（用提取液A补齐到1.1mL）， 于95℃孵育5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃离心10min；取500μL 上清液至新离心管中，再加V1体积的提取液B中和（可分次添加提取液B，调至PH约中性， 记录提取液B加入体积为V1）；12000rpm4℃离心5min，取上清置冰上待测。 (b) NADH的提取：

在离心管中加入约0.1mL液体样本，然后再加入1mL提取液B（用提取液B补齐到1.1mL）， 于95℃孵育5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃离心10min；取500μL 上清液至新离心管中，再加V2体积的提取液A中和（可分次添加提取液A，调至PH约中性， 记录提取液A加入体积为V2）；12000rpm 4℃离心5min，取上清液置于冰上待测。

【注】：若测出值较低，可加大样本取样量，如增至0.5mL等，可做几个梯度选择适合本次实验的样本量。

二、样品测定 ：

1. 酶标仪预热30min 以上，温度设定37℃，调节波长至450nm。

2. 在96孔板中依次加入：

【注】若ΔA过小，可加大样本取样质量W；或增加样本量V1（由20增至40μL，则试剂三相应减少），或延长反应时间（如：60min或更长）；则改变后的相应变量需代入计算公式重新计算。

三、含量计算：

1. 标准曲线：y=4.2609x-0.0071：x是NADH摩尔质量（nmol），y 是ΔA。

2. NAD+含量的计算：

(1) 按样本鲜重计算：

NAD+(nmol/g 鲜重）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(W÷2×V÷V3)

=23.47×(△A+0.0071)×(0.5+V1)÷W

(2) 按细菌或细胞密度计算：

NAD+(nmol/10⁴cell）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(500÷2×V 样÷V3)

=0.047×(△A+0.0071)×(0.5+V1)

(3) 液体中NAD+含量计算：

NAD+含量(nmol/mL）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(V 液÷2×V 样÷V3)

=234.7×(△A +0.0071)×(0.5+V1)

3. NADH含量的计算：

(1) 按样本鲜重计算：

NADH(nmol/g 鲜重）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(W÷2×V÷V4)

=23.47×(△A+0.0071)×(0.5+V2)÷W

(2) 按细菌或细胞密度计算：

NADH(nmol/10⁴ cell）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(500÷2×V÷V4)

=0.047×(△A+0.0071)×(0.5+V2)

(3) 液体中NADH含量计算：

NADH含量(nmol/mL）=[(△A+0.0071)÷4.2609]÷(V 液÷2×V样÷V4)

=234.7×(△A+0.0071) ×(0.5+V2)

V样----加入反应体系中样本体积，0.02mL

V液----所取液体样本体积：0.1mL

V3---NAD+提取液体积，0.5mL提取液A+V1mL提取液B=（0.5+V1）mL

V4---NADH 提取液体积，0.5mL提取液B+V2mL提取液A=（0.5+V2）mL

W----样本质量，g

500----细胞或细菌总数，500万

NADH分子量----663.4

附：标准曲线制作过程：

1. 制备标准品母液（1μmol/mL）：向标准品离心管里面加入1.41mL蒸馏水（NADH不太稳定，取出NADH后请尽快使用。如果发现标准曲线不理想，很有可能是标准品发生了降解）。 

2. 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0，1，2，3，4，5 nmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。

3. 依据测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。

注意事项：

1.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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