NADH-谷氨酸合成酶(NADH-GOGAT)活性检测试剂盒

 非绿色组织 微板法

产品简介：

谷氨酸合成酶（GOGAT）一般包含两类：一类是多存在于叶绿体（叶片）中的Fd-GOGAT， 另一类是多存在于非绿色组织（根）前质体中的NADH-GOGAT。GOGAT广泛分布于植物中，植物吸收的无机氮经硝酸还原糖（NR）和亚硝酸还原酶（NIR）还原成NH4+后，通过谷氨酰 胺合成酶（GOGAT）参与的GS/GOGAT途径才能进行氮素的同化和利用。

NADH-谷氨酸合成酶（NADH-GOGAT，EC1.4.1.14) 催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸；同时NADH氧化生成NAD+，可以通过检测340nm吸光度的下降速率得出NADH-GOGAT的酶活性大小。

该酶催化的反应：L-glutamine+2-oxoglutarate + NADH + H+=2 L-glutamate + NAD+。

保存条件: 

2-8℃保存，三个月有效。

产品组成：

产品使用：

建议正式实验前，选取 2 个样本做预测定，了解实验样品情况，熟悉流程，避免样本和 试剂浪费！

一、样本准备：

1. 组织样本：

(a) 称取约0.1g组织（水分充足的样本可以取0.5g），加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；

(b) 12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上测定。

【注】：1. 根据研究需求，可按组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

2. 若样本颜色较深（如植物叶片），可引起起始值A1值较大如超过1.5，可在样本制备过程中增加除色素步骤：取约0.2g组织（水分充足的样本可取1g），加入80%乙醇冰浴匀浆，12000rpm，4℃ 离心10min，弃掉色素较深的上清液；以上除色素步骤重复2次。最后向离心得到的沉淀中加入1mL 提取液，混匀或再次冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌/细胞样本：

(a) 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；

(b) 取5×10⁶个细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；

(c) 12000rpm，室温离心15min，取上清测定。

【注】：若增加样本量，可按每0.5~1×10⁷个细菌/细胞数量加入1mL提取液的比例进行提取。

二、样品测定：

1. 酶标仪预热30min，设定波长到340nm。

2. 在96孔板中依次加入：

【注】：1.若A1太大如超过2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏高），可以适当 减少样本加样量V1（如减至10μL，另外10μL用提取液补齐），则改变后的V1需代入计算公式重新计算。或者减少试剂一的加样量（如减至20μL，另外20μL用蒸馏水补齐）或向待测样本中加少许活性炭混匀静置5min后12000rpm,4℃离心10min，上清液用于检测；

2. 若ΔA的值大于0.4，则需减少反应时间（如减少至5min），则改变后的反应时间T需代入计算公式重新计算。

3. 若下降趋势不稳定，可以每隔20S读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的A值也代入计算公式重新计算。

三、结果计算

1. 按蛋白浓度计算：

单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

NADH-GOGAT(nmol Glu/min/mg prot）=2×[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(V1×Cpr) ÷T =6430.9×ΔA÷Cpr ÷T

2. 按样本质量计算：

单位定义：每克组织每分钟消耗1nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。

NADH-GOGAT（nmol Glu/min/g 鲜重）=2×[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V1÷V) ÷T =6430.9×ΔA÷W÷T

V--提取液体积，1mL

V1--加入样本体积，0.02mL

V2--反应总体积，2×10^-4L

ε--NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm

d--96 孔板光径，0.5cm

W--样本质量，g

T--反应时间，本实验中是10min

Cpr---上清液蛋白质浓度（mg/mL）

2--每合成2nmol的Glu有1nmol的NADH被氧化

注意事项：

1.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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