NADP+/NADPH检测试剂盒(WST-8法)

产品简介：

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamideadeninedinucleotide phosphate, NADP)是很多氧化还原反应的辅酶，包括NADP+(氧化型)和NADPH(还原型)两种形式。NADP+也参与到生物合成反应中，比如脂质和核酸的合成。传统的NAD+/NADH和NADP+/

NADPH测定是通过检测340nm处的吸收来完成的，该方法灵敏度低且易受干扰。而本试剂盒可以特异性地检测NADP+和NADPH，而不检测NAD+和NADH，在反应过程中NADP+被还原为NADPH，NADPH将WST-8还原成橙黄色formazan（甲臜），在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中NADP+或NADPH的总量呈比例关系。一次本产品基于WST-8的显色反应，通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中NADP+(氧化型辅酶Ⅱ)和NADPH(还原型辅酶Ⅱ)各自的量、比值和总量的检测试剂盒。

保存条件: 

-20℃保存1年。

显色液(NBS8095-2)和NADPH(NBS8095-3)须-20℃避光保存。

NADPH配制成溶液后，须适当分装后-80℃保存。所有试剂避免反复冻融。

产品组成：

产品使用：

1. 样品的准备：

(a) 细胞样品的准备：

对于贴壁细胞，约1×10⁶个细胞(大约相当于6孔板一个孔长满的细胞数量)，吸净培养液，用移液器加入200μL预冷的NADP+/NADPH提取液，并轻轻吹打，以促进细胞的裂解；对于悬浮细胞，约1×10⁶个细胞，600g离心5分钟，吸净培养液，用移液器加入200μL预冷的NADP+/NADPH提取液，并轻轻吹打，以促进细胞的裂解；裂解过程在室温或冰上操作均可。随后12,000g，4℃离心5-10分钟，取上清作为待测样品备用。

(b) 组织样品的准备：

冰上预冷的PBS洗涤组织后，称取约10-30mg的组织样品，用剪刀剪碎，置于匀浆器中，加入400μL的NADP+/NADPH提取液在室温或冰上进行匀浆。随后12,000g，4℃离心5-10分钟，取上清作为待测样品备用。

2. 试剂盒的准备工作：

(a) NADPH标准品的配制：

吸取6mL超纯水充分溶解本试剂盒提供的5mg NADPH后即得到1mM NADPH标准品。1mM NADPH标准品请适当分装后-80℃避光保存。

(b) NADPH标准曲线的设置：

把1mM的NADPH标准品用NADP+/NADPH提取液稀释成适当的浓度梯度，如初次检测可以设置0、0.25、0.5、1、2、4、6、8μM这几个浓度，检测时96孔板每孔加入50μL的标准品，相当于每孔为0、12.5、25、50、100、200、300、400pmol的NADPH。如有必要，在后续的实验中可以根据样品中的NADPH含量对标准品的浓度 范围进行适当调整。其中浓度为0uM的点为空白对照点，仅含NADP+/NADPH提取液。

注意：由于NADPH很不稳定，故配制后需尽快使用。

(c) G6PDH工作液的配制：

将G6PDH用反应缓冲液稀释50倍，例如2μL G6PDH加入到98μL的反应缓冲液中，即可获得100μL的G6PDH工作液。每个标准品或样品的检测需要使用100μL的G6PDH工作液，请根据所需检测的标准品和样品的数量，配制适量的G6PDH工作液，并注意现配现用。

3. 样品测定：

(a) 样品中NADP+和NADPH总量的测定：

吸取50μL待测样品至96孔板中，为了减少实验 误差请设置样品的重复孔。后续如果发现样品中的NADP+和NADPH的总量过高，超出标准曲线的范围，则需要用NADP+/

NADPH提取液将样品适当稀释后再进行检测；总量过低时则需要加大细胞或组织样品的用量。

(b) 样品中NADP+、NADPH的含量或者NADP+/NADPH比值的测定：

吸取100-200μL待测样品于离心管中，60℃水浴或PCR仪上加热30分钟以分解NADP+。如果加热后产生不溶物，则需10,000g，室温或4℃离心5分钟，吸取50μL上清液作为待测样品至96孔板中，为了减少实验误差建议设置样品的重复孔。后续如果发现样品中的NADP+或NADPH的含量过高，超出标准曲线的范围，则需要用NADP+/NADPH提取液将样品适当稀释后再进行检测；含量过低时则需要加大细胞或组织样品的用量。

(c) 请参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。加入G6PDH工作液后充分混匀。

(d) 37℃避光孵育10分钟。说明：此孵育步骤的目的是将样品中的NADP+转化为NADPH； 在加入G6PDH工作液过程中须轻柔操作，以免产生气泡。若不慎出现气泡，可使用细小的吸头或针头戳破。

(e) 适当混匀显色液，然后每孔加入10μL显色液，混匀，37℃避光孵育10-20分钟，此时会形成橙黄色的formazan。测量450nm处的吸光度。如果显色较浅，也可以适当延长孵育时 间至30-60分钟，随着孵育时间延长，显色会逐渐加深。

4. 结果结算：

(a) 计算标准品组中每个点的平均吸光度，减去空白对照组的吸光度，即为各个标准品的吸光 度。

(b) 以 NADPH的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。NADPH标准品的检测效果请参考图1。如果孵育时间过长，高浓度标准品的显色会达到平台，此时宜选择未达到平台的标准品来绘制标准曲线，或者选择孵育时间较短的标准品吸光度数据来绘制标准 曲线。

图1.NADPH的标准曲线。上图显示本试剂盒可以很好地检测出NADPH的含量，并且不会受 NADH的干扰。不同的检测条件下，实际读数会因标准品的配制、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

(c) 根据标准曲线计算细胞、组织等样品中的NADP+和NADPH总浓度或者NADPH的浓度。

未60℃加热处理时，计算得到的是样品中NADP+和NADPH总量的浓度(NADPtotal)；60℃加热处理后，检测得到的是样品中NADPH的浓度。

备注：根据检测得到的浓度及样品的体积，即可计算出NADP+、NADPH、NADPtotal的量。

(d) 根据检测得到的浓度及样品的体积，即可计算出NADP+、NADPH、NADPtotal的量。 (e) [NADP+] = [NADPtotal]- [NADPH]

[NADP+]/[NADPH] = ([NADPtotal]- [NADPH])/[NADPH]

(f) 如果希望更加精确地来表述NADP+和NADPH总量或各自的含量，可以将样品用BCA法测定蛋白浓度。最终用单位蛋白量中NADP+和NADPH总量或各自的含量来比较精确地进行表述。

注意事项：

1.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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