NAD+/NADH检测试剂盒(WST-8法)

产品简介：

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamideadenine dinucleotide, NAD)是所有细胞中都存在的一种辅酶，包括 NAD+(氧化型)和NADH(还原型)两种形式。NAD+在细胞和体内发挥着重要的功能，参与细胞凋亡、代谢调控和基因表达的调控等，并且NAD+的减少是细胞死亡的主要因素之一。传统的NAD+/NADH以及NADP+/NADPH测定是通过检测340nm处的吸收来 完成的，该方法灵敏度低且易受干扰。本产品基于 WST-8 的显色反应，通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中NAD+(氧化型辅酶Ⅰ)和NADH(还原型辅酶Ⅰ)各自的量、比值和总量的检测试剂盒。NAD/NADH检测试剂盒能特异性地检测NAD+和 NADH，而不检测NADP+和NADPH，在反应过程中NAD+被还原为NADH，NADH将WST-8还原成橙黄色formazan（甲臜），在 450nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中NAD+或NADH的总量呈比例关系。

保存条件: 

-20℃保存，1年有效。

显色液(NBS8094-2)和NADH(NBS8094-3)须-20℃避光保存。

NADH配制成溶液后，须适当分装后-80℃保存。所有试剂避免反复冻融。

产品组成：

产品使用：

1. 样品的准备：

(a) 细胞样品的准备：

对于贴壁细胞，约1×10⁶个细胞(大约相当于6孔板一个孔长满的细胞数量)，吸净培养液，用移液器加入200μL预冷的NAD+/NADH提取液，并轻轻吹打，以促进细胞的裂解；对于悬浮细胞，约1×10⁶个细胞，600g离心5分钟，吸净培养液，用移液器加入200μL预冷的NAD+/NADH提取液，并轻轻吹打，以促进细胞的裂解；裂解过程在室温或冰上操作均可。随后12,000g，4℃离心5-10分钟，取上清作为待测样品备用。

(b) 组织样品的准备：

冰上预冷的PBS洗涤组织后，称取约10-30mg的组织样品，用剪刀剪碎，置于匀浆器中，加入400μL的NAD+/NADH提取液在室温或冰上进行匀浆。随后12,000g， 4℃离心5-10分钟，取上清作为待测样品备用。

2. 试剂盒的准备工作：

(a) NADH标准品的配制：

吸取655μLNADH配制液，充分溶解本试剂盒提供的5mgNADH 后即得到10mM NADH标准品。10mM NADH标准品请适当分装后-80℃避光保存。

(b) NADH标准曲线的设置：

将10mM的NADH标准品用NAD+/NADH提取液稀释成适当的浓度梯度，如初次检测可以设置0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10μM这几个浓度，检测时96孔板中每孔加入20μL的标准品，相当于每孔为0、5、10、20、40、80、120、160、 200pmol的NADH。如有必要，在后续的实验中可以根据样品中的NADH含量对标准品的浓度范围进行适当调整。其中浓度为0μM的点为空白对照点，仅含NAD+/NADH提取液。

注意：由于NADH很不稳定，故配制后需尽快使用。

(c) 乙醇脱氢酶工作液的配制：

将乙醇脱氢酶用反应缓冲液稀释45倍，例如2μL乙醇脱氢酶加入到88μL的反应缓冲液中，即可获得90μL的乙醇脱氢酶工作液。每个标准品或样品的检测需要使用90μL的乙醇脱氢酶工作液，请根据所需检测的标准品和样品的数量，配制适量的乙醇脱氢酶工作液，并注意现配现用。

3. 样品测定：

(a) 样品中NAD+和NADH的总量的测定：

吸取20μL待测样品至96孔板中，为了减少实验误差建议设置样品的重复孔。后续如果发现样品中的NAD+和NADH的总量过高，超出标准曲线的范围，则需要用NAD+/NADH提取液将样品适当稀释后再进行检测；总量过低时则需要加大细胞或组织样品的用量。

(b) 样品中NAD+、NADH 的含量或者NAD+/NADH比值的测定：

吸取50-100μL待测样品于离心管中，60℃水浴或PCR仪上加热30分钟以分解NAD+。如果加热后产生不溶物，则需10,000g，室温或4℃离心5分钟，吸取20μL上清液作为待测样品至96孔板中，为了减少实验误差建议设置样品的重复孔。后续如果发现样品中的NAD+或NADH的含量过高，超出标准曲线的范围，则需要用NAD+/NADH提取液将样品适当稀释后再进行检测；含量过低时则需要加大细胞或组织样品的用量。

(c) 请参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。加入乙醇脱氢酶工作液后 充分混匀。

(d) 37℃避光孵育10分钟。说明：此孵育步骤的目的是将样品中的NAD+转化为NADH；在加入乙醇脱氢酶工作液的过程中须轻柔操作，以免产生气泡。若不慎出现气泡，可使用细小的吸头或针头戳破。

(e) 适当混匀显色液，然后每孔加入10μL显色液，混匀，37℃避光孵育30分钟，此时会形成橙黄色的formazan。测量450nm处的吸光度。如果显色较浅，也可以适当延长孵育时间至45-60分钟。

4. 结果结算：

(a) 计算标准品组中每个点的平均吸光度，减去空白对照组的吸光度，即为各个标准品的吸光度。

(b) 以 NADH的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。NADH标准品的检测效果请参考图1。

图1.NAD+和NADH的标准曲线。上图显示本试剂盒可以很好地检测出NAD+和NADH的含量，并且不会受NADPH的干扰。不同的检测条件下，实际读数会因标准品的配制、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

(c) 根据标准曲线计算细胞、组织等样品中的NAD+和NADH总浓度或者NADH的浓度。未60℃加热处理时，检测得到的是样品中NAD+和NADH总量的浓度(NADtotal)；

60℃加热处理后，检测得到的是样品中NADH的浓度。

备注：根据检测得到的浓度及样品的体积，即可计算出NAD+、NADH、NADtotal的量。

(d) 根据如下计算公式，计算样品中NAD+的量以及NAD+/NADH的比值。此时可以把NAD+和NADH总量或各自的含量用单位细胞数量或单位组织重量中的含量来表示。 [NAD+] = [NAD total]- [NADH]

[NAD+]/[NADH] = ([NAD total]- [NADH])/[NADH]

(e) 如果希望更加精确地来表述NAD+和NADH总量或各自的含量，可以将样品用BCA法测定蛋白浓度。最终用单位蛋白量中NAD+和NADH总量或各自的含量来比较精确地进行表述。

注意事项：

1.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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