植物丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法)

产品简介：

动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress)时，会发生脂质氧化。丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物，一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列包括MDA在内的复杂化合物，此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。生物体内的一些其它生化反应也会产生MDA，例如thromboxane synthase也可以催化产生，但只要在测定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。

植物丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法)(Plant MDA Assay Kit with TBA)又称脂质氧化(MDA)检测试剂盒，是采用一种基于MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)反应产生红色产物的显色反应，随后通过比色法用于对植物组织(根、茎、叶、种子等)MDA进行检测，是专门用于植物脂质氧化(lipid peroxidation)水平检测的试剂盒，不适用于动物组织、细胞、血液等；丙二醛在较高温度及酸性环境中可与TBA发生反应，形成红色的MDA-TBA加合物，MDA-TBA加合物在532nm处有最大吸收，该复合物的吸光系数为155mmol/(L.cm)，并且在600nm波长处有最小吸收，植物组织中糖类物质对MDA-TBA反应有干扰，我们总结出经验公式，以消除这一干扰，亦可以通过比标准品进行比较，进行含量检测。

产品组成：

保存条件: 

-20℃避光保存，1年有效。

自备材料：

剪刀、离心管、小试管或96 孔板、分光光度计或酶标仪、水浴锅或恒温箱、离心机

产品使用：（仅供参考）

1、样本处理：

①制备MDA 提取液：取适量的植物根、茎、叶子、种子等，称量后剪碎，按每0.4g植物样品加入4ml的比例加入组织匀浆液，充分匀浆(一般取0.4～1g植物样品即可)。4000g离心10min，取上清液待用，该上清液即为MDA 提取液；如果采用酶标仪检测结果，应相应减少制备提取液的量，譬如取0.2g植物样品加入2ml组织匀浆液。

②样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量植物样品的MDA含量；测定蛋白浓度非必须步骤，亦可采用经验公式计算。

③该试剂盒对于样品中的常见化学成分的兼容性参考下表：

2、配制TBA 工作液：

称取适量TBA，用组织匀浆液配制成浓度为0.68％的TBA工作液，例如取0 .068g TBA 用10ml组织匀浆液配制，最终浓度即为0.68%的TBA工作液。TBA工作液需完全溶解后再使用，可以加热到60℃促溶，并可通过反复剧烈Vortex促溶；配制好的TBA工作液4℃避光保存，至少1个月内有效。

3、稀释标准品：

如果进行简易快速检测，标准品直接稀释至10μM；如果进行精确检测，取适量标准品用组织匀浆液稀释至1、2、5、10、20、50μM；如果采用经验公式计算含量，无需标准品；配制好的MDA标准品4℃避光保存，至少3个月内有效。

4、样品测定:

①分光光度计测定：在离心管或其它适当容器内加入1ml 组织匀浆液作为空白对照，加入1 ml MDA提取液用于测定，随后加入1ml TBA工作液。可参考下表设置检测反应体系，依次加入试剂：

②酶标仪测定：在离心管或其它适当容器内加入200μl组织匀浆液作为空白对照，加入200μl MDA提取液用于测定，随后加入200μl TBA工作液。可参考上表设置检测反应体系，依次加入试剂(抗氧化剂加入5μl)。

③混匀,加盖，95℃水浴煮沸30min，加热时务必注意避免液体暴沸溅出。如果使用加热块(Heat block)进行加热注意用重物压紧离心管盖；如果使用沸水浴，则需使用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管或用Parafilm 封住离心管口，用针头刺一小孔。最方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热的金属浴或者0.5 ml PCR仪。

④冷水浴或流水冷却至室温，4000g 离心10min。

⑤取上清，蒸馏水调零，用分光光度计或酶标仪测定532nm处吸光度，如果不方便也可以测定530 ~540nm之间的吸光度，分别记为A_空白、A_标准、A_测定；如果采用经验公式计算，应分别测定450nm、532nm、600nm处的吸光度，分别记为A₄₅₀、A₅₃₂、A₆₀₀。

5、计算：

如果进行简易快速检测，直接以10μM标准品进行计算，获得MDA的摩尔浓度；如果采用经验公式，无需制作标准曲线或测定标准品；如果需要精确计算，以MDA 标准品浓度为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据标准曲线计算处MDA提取液的浓度；对于固体状组织，可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量，例如μmol/g 蛋白或μmol/g组织。

简易快速MDA 含量计算公式：

MDA含量(μmol/g蛋白)=(A_测定-A_空白)/(A_标准-A_空白)×标准品浓度/蛋白质质量浓度

式中：A测定=待测样品的532nm 处吸光度

A标准=标准品的532nm 处吸光度

A空白=空白对照的532nm 处吸光度

标准品浓度=10μmol/L

蛋白质质量浓度(mg/ml =g/L)=BCA法测定的蛋白浓度(mg/ml)

不采用标准品的经验公式：

MDA浓度(μmol/L)=6.45×(A₅₃₂-A₆₀₀)-0.56×A₄₅₀

MDA含量(μmol/g 组织)=MDA浓度(μmol/L)×MDA提取液体积(L)/植物组织鲜重(g)

式中：A₅₃₂ =待测样品的532nm处吸光度

A₆₀₀ =待测样品的600nm处吸光度

A₄₅₀ =待测样品的450nm处吸光度

注意事项：

1.      上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。

2.      待测样品尽量新鲜，提取后应尽快检测，以免活性下降。

3.      待测MDA提取液如不能及时测定，应置于-20℃保存，4天内稳定。

4.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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