丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA荧光法)

产品简介：

动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress)时，会发生脂质氧化。丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物，一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列包括MDA在内的复杂化合物，此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。生物体内的一些其它生化反应也会产生MDA，例如thromboxane synthase也可以催化产生，但只要在测定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。

丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA荧光法，MDA Assay Kit)又称脂质氧化(MDA)检测试剂盒，是采用一种基于MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)反应产生红色产物的显色反应，随后通过荧光比色法用于对血浆、血清、尿液、动植物组织或细胞裂解液中MDA进行定量检测，广泛用于脂质氧化(lipid peroxidation)水平检测。丙二醛在较高温度及酸性环境中可与TBA发生反应，形成红色的MDA-TBA加合物，MDA-TBA加合物在553nm处有最大吸收，以515nm为激发光，据此可以通过荧光比色法进行检测。

产品组成：

保存条件: 

-20℃避光保存，1年有效。

自备材料：

蒸馏水、离心管、小试管或96 孔板、荧光分光光度计或荧光酶标仪、离心机、水浴锅或恒温箱

产品使用：（仅供参考）

1、样本处理：

①血清、血浆、尿液、脑脊液样本：从待测样本中分理出的血清或血浆不应有溶血。取20μl 待测液体样本，依次加入0 .5 ml MDA 沉淀液、3.5 ml 蒸馏水和0 .5 ml磷钨酸溶液，摇匀，室温静置5 min，3500r/min 离心10min，弃上清。沉淀加入1ml蒸馏水，振荡混匀2 min，以便充分溶解沉淀(MDA 样品)，即获得MDA待测液。

②组织、细胞等样本：组织或细胞可以使用PBS 或Western及IP 细胞裂解液等进行匀浆或裂解。匀浆或裂解组织时，组织重量占匀浆液或裂解液的比例应为10%；对于细胞，每10⁶ 个细胞使用0 .1 ml裂解液或匀浆液。匀浆或裂解后，1600r/min离心10min，取上清用于后续测定。匀浆或裂解等样品制备步骤宜在冰浴或4℃进行操作。样品准备完毕后可以用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的MDA 含量。取20μl待测匀浆后提取的上清，依次加入0.5 ml MDA沉淀液、3.5 ml蒸馏水和0.5 ml 磷钨酸溶液，摇匀，室温静置5 min，3500r/min离心10min，弃上清。沉淀加入1ml 蒸馏水，振荡混匀2 min，以便充分溶解沉淀(MDA 样品)，即获得MDA待测液。

③本试剂盒对于样品中的常见化学成分的兼容性参考下表：

2、稀释标准品：

取适量MDA标准品(1mmol/L)用蒸馏水稀释至0.5、1、2、5、10μM(如果进行简易快速检测，标准品直接稀释至0 .5μM)。

3、配制TBA 工作液：

称取适量TBA，用TBA 稀释液配制成浓度为0 .68％的TBA工作液。例如取34mg TBA 用5 ml TBA 稀释液配制，最终浓度即为0.68%的TBA 工作液。TBA工作液需完全溶解后再使用，可以加热到60℃促溶，并可通过反复剧烈Vortex促溶。

4、MDA 加样:

在离心管或其它适当容器内参考下表设置检测反应体系，依次加入试剂：

混匀,加盖，95℃准确水浴煮沸60min (勿动)，加热时务必注意避免液体暴沸溅出。如果使用加热块(Heat block)进行加热注意用重物压紧离心管盖；如果使用沸水浴，则需使用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管，或用Parafilm 封住离心管口，用针头刺一小孔。最方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热的金属浴仪器。

5、MDA 测定：

水浴或流水冷却至室温，加入MDA分离液3.5 ml，振摇并抽提1 min，3000r/min 离心5 min，取上清，蒸馏水调零，用荧光光度计或荧光酶标仪检测荧光强

度，激发光515nm，发射光553nm。

6、计算：

对于血浆、血清或尿液等样品，以MDA标准品浓度为横坐标，以对应的荧光强度为纵坐标，制作标准曲线，根据标准曲线计算处MDA 提取液的浓度；如果进行简易快速检测，直接乘以0 .5 μM 标准品进行计算获得MDA 的摩尔浓度，对于细胞、或组织样品，计算出样品溶液中的MDA 含量后，可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量，例如μmol/mg蛋白或μmol/mg组织。

简易快速血清、血浆、尿液等液体样品中MDA含量计算公式：

MDA浓度(μmol/L)=(A_测定-A_空白)/(A_标准-A_空白)×25

简易快速细胞、组织样品中MDA含量计算公式：

MDA浓度(μmol/mg)=(A_测定-A_空白)/(A_标准-A_空白)×25/蛋白质浓度(mg/ml)

式中：A_测定=测定孔的荧光强度

A_标准=标准孔的荧光强度

A_空白=空白孔的荧光强度

参考区间：

健康成年人血清MDA：1.63±0.38μmol/L

60岁以上的健康成年人血清MDA：2.14±0.56μmol/L

注意事项：

1.      上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。

2.      参考取样量：血清、血浆、尿液取20μl；低密度脂蛋白悬液取20～40μl；食用油取30μl；肝脏、心肌、肌肉等，取5%或10%匀浆20～40μl。

3.      待测样本如不能及时测定，应置于-20℃保存，4 天内稳定。

4.      避免使用EDTA、枸橼酸、氟化钠、草酸等抗凝剂。

5.      稀释后的MDA 标准品4℃避光保存，3 个月内有效。

6.      TBA工作液应4℃避光保存，1 个月有效。

7.      MDA测定步骤中，离心分层抽取上层时，若出现浑浊，可加1 滴无水乙醇。

8.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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