丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法)

产品简介：

动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress)时，会发生脂质氧化，丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物，一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列包括MDA在内的复杂化合物，此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。生物体内的一些其它生化反应也会产生MDA，例如thromboxane synthase也可以催化产生，但只要在测定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。

丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法，MDA Assay Kit)又称脂质氧化(MDA)检测试剂盒，是采用一种基于MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)反应产生红色产物的显色反应，随后通过比色法用于对血浆、血清、尿液、动植物组织或细胞裂解液中MDA进行定量检测，广泛用于脂质氧化(lipid peroxidation)水平检测，丙二醛在较高温度及酸性环境中可与TBA发生反应形成红色的MDA-TBA加合物，MDA-TBA加合物在535nm处有最大吸收，据此可以通过比色法进行检测，另外MDA-TBA加合物也可以在535nm被激发产生最大发射波长553nm，据此也可以进行荧光检测。

产品组成：

保存条件: 

-20℃避光保存，1年有效。

产品使用：（仅供参考）

1、准备样品：

①血清、血浆、尿液、脑脊液样品：从待测样本中分离出的血清或血浆不应有溶血，直接检测，如超过线性范围，用生理盐水或PBS 稀释后检测。

②组织、细胞等样品：组织或细胞可以使用PBS或RAPI裂解液等进行匀浆或裂解，匀浆或裂解组织时组织重量占匀浆液或裂解液的比例应为10%；对于细胞，每10⁶个细胞使用0 .1 ml裂解液或匀浆液，匀浆或裂解后4℃ 8000 ~12000g 离心10min，取上清用于后续测定。匀浆或裂解等样品制备步骤宜在冰浴或4℃条件下进行操作，样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内MDA含量。

③该试剂盒对于样品中的常见化学成分的兼容性参考下表：

2、配制TBA 工作液：

称取适量TBA，用TBA 稀释液配制成浓度为0 .68％的TBA工作液；例如取68mg TBA 用10 ml TBA稀释液配制，最终浓度即为0.68%的TBA工作液，TBA工作液需完全溶解后再使用，可以加热到60℃促溶，并可通过反复剧烈Vortex促溶；配制好的TBA工作液4℃避光保存，至少1个月内有效。

3、稀释系列标准品：

取适量MDA 标准品(1mmol/L)，用恰当溶液稀释至2、4、6、8、10μM(如果进行简易快速检测，标准品直接稀释5μM)。注意：待测样品为血清、血浆时，标准品宜用生理盐水稀释；待测样品由匀浆液、裂解液、PBS 获得时，标准品宜用相同溶液稀释，其原则是保证空白管、标准管、测定管具有可比性；配制好的MDA 标准品4℃避光保存，至少3个月内有效。

4、配制MDA 检测工作液：

临检测前，根据待测定的样品数(含对照)，参考下表新鲜配制适量的MDA检测工作液。

5、MDA 加样:

在离心管或其它适当容器内加入0.08ml适当溶液作为空白对照(注意：待测样品为血清、血浆时，标准品宜用生理盐水稀释；待测样品由匀浆液、裂解液、PBS获得时，标准品宜用相同溶液稀释，其原则是保证空白管、标准管、测定管具有可比性)，加入0.08ml上述不同浓度标准品用于制作标准曲线(如果进行简易快速检测，直接加入浓度10μM的标准品)，加入0.08ml样品用于测定；随后加入3ml MDA检测工作液。可参考下表设置检测反应体系，依次加入试剂：

混匀,加盖，95℃水浴煮沸40min，加热时务必注意避免液体暴沸溅出；如果使用加热块(Heat block)进行加热注意用重物压紧离心管盖；如果使用沸水浴，则需使用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管或用Parafilm封住离心管口，用针头刺一小孔；最方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热金属浴。

6、MDA 测定：

水浴或流水冷却至室温，3000r/min离心15min或4000r/min离心10min，取上清，其颜色为黄色至棕红色，蒸馏水调零，比色杯光径应为1cm，分光光度计测定测定535nm处吸光度，如果不方便也可以测定530 ~540nm之间的吸光度，分别记为A_空白、A_标准、      A_测定。

7、计算：

如果进行简易快速检测，直接以10μM标准品进行计算，获得MDA的摩尔浓度；

如果需要精确计算，以MDA标准品浓度为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据标准曲线计算出MDA 提取液的浓度(C₁，μmol/L)；对于固体状组织，可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA 含量(C₂，μmol/g)，例如μmol/g蛋白或组织。

简易快速血清、血浆、尿液等液体样品中MDA 含量计算公式：

MDA 浓度(μmol/L)=C₁ =(A_测定-A_空白)/(A_标准-A_空白)×5

简易快速细胞、组织样品中MDA 含量计算公式：

MDA含量(μmol/g)=C₂ =(A_测定-A_空白)/(A_标准-A_空白)×5/蛋白质浓度(mg/ml)=C₁/蛋白质浓度(mg/ml)

MDA含量(μmol/g)=C₂ =(A_测定-A_空白)/(A_标准-A_空白)×5/[w/(v_总×10^-3)]=C₁/[w/(v_总×10^-3)]

式中：A_测定=测定孔的吸光度   w =组织样品质量(g)   A_标准=标准孔的吸光度 

v_总=样本提取液总体积(ml)   A_空白=空白孔的吸光度

参考区间：

健康成年人血清MDA：9.58±2.15μmol/L   血浆MDA：7.31±1.27μmol/L

注意事项：

1.      上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。

2.      参考取样量：血清、血浆、尿液取100μl；低密度脂蛋白悬液取100～200μl；食用油取30μl；肝脏、心肌、肌肉等，取5%或10%匀浆100 ~200μl。

3.      测定样品吸光度值较低时，可将水浴延长至80min，但应同时延长，以免造成批间差异。

4.      待测样本如不能及时测定，应置于-20℃保存，4天内稳定。

5.      避免使用EDTA、枸橼酸、氟化钠、草酸等抗凝剂。

6.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

附录：

参考标准曲线范围：测定MDA标准在10μM时，通过酶标仪测定其吸光度多在1 .3 ~2.3 之间(未调零)；测定MDA标准在1、2、4、6、8、10、12、14μM时吸光度，据此作出其标准曲线如下：

注意：由于检测仪器和操作手法等条件的不同，参考值范围会有波动，该值仅供参考，对于要求精确计算MDA含量的，可以进行多点测定；根据测定经验显示，标准品浓度在2μmol/L 以下，标准品浓度在16μmol/L以上，标准曲线会有偏差。

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