T7高产体外转录试剂盒

T7 High Yield RNA Synthesis Kit

产品简介：

  T7 High Yield RNA Synthesis Kit 是一种使用 T7 RNA 聚合酶，以带有 T7 启动子的 DNA 为模板，通过体外转录大量合成RNA的试剂盒,适用于长链和短链转录本。本品提供的T7 Enzyme Mix中已经预混了RNase抑制剂与无机焦磷酸酶，而 DNase l,RNase-free 用于转录反应结束后清除模板DNA。使用本品以1 μg 线性化双链 DNA 模板可以转录获得至少150 μg以上的 RNA。通过转录合成的 RNA可用于多种下游应用如体外翻译、RNA结构和功能研究、RNase 保护、探针杂交、RNA干扰等。

转录方案：

图1.非共转录T7启动子RNA转录方案

产品组成：

保存条件: 

-20℃保存，1年有效。

适用范围：

1. 合成单链RNA，包括mRNA，siRNA，gRNA等各类RNA的前体。
2. 合成标记或未标记的高特异性RNA探针。 
3. 利用帽子类似物合成加帽的mRNA。

使用方法：

1. DNA 模板制备

带有T7启动子的线性化质粒或PCR扩增产物都可以作为体外转录模板，模板可以用TE缓冲液或Nuclease-Free Water溶解。

T7启动子序列：TAATACGACTCACTATAN*

注：N*为 RNA 转录的第一个碱基,一般为G，若进行共转录由帽子类似物决定。

（1）质粒模板

将目的DNA插入含有T7启动子的质粒载体中，然后用限制酶进行处理，待完全线性化后进行纯化。

注1：由于终止子不能保证转录100%终止，环状质粒会转录出不同长度的RNA产物。为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化。

注2：质粒线性化所选限制酶的酶切位点需要紧邻编码链下游，且在编码链中无识别位点。选择的限制酶要能形成5'突出末端或者平滑末端。

注3：为了避免蛋白及盐离子等对转录体系的影响，线性化质粒建议纯化后再作为模板进行体外转录。

注4：质粒DNA抽提过程中引入的RNase A残留会显著影响转录RNA的质量，建议使用A260/A280为1.8~2.0的高纯度RNase-free模板。

（2）PCR产物模板

带 T7 启动子的PCR产物可以作为体外转录模板。首先将T7启动子序列加在编码链上游引物的5'端，然后在高保真酶的作用下扩增含T7 启动子的DNA模板，随后进行转录。PCR产物可以不经纯化直接作为模板，但纯化后RNA收率会更高。

注1：PCR产物作为模板，必须电泳确认产物的特异性及浓度，建议20 μl反应体 系投入2~5 μl PCR产物。

注2：为了得到更多高品质的RNA，推荐PCR产物纯化之后再作为模板进行体外转录。

2. 体外转录

（1）根据所需产物类型选择下面三个反应体系进行反应溶液加样。

① 标准体外转录体系

在冰上配制如下反应体系：

a. 建议先加入Nuclease-Free Water, 然后再加入 ATP/CTP/GTP/UTP。

b. 可以用同样摩尔浓度的修饰NTP替代相应的未修饰NTP。修饰UTP可参考使用 N¹-Methyl-Pseudo-UTP(100mM)和Pseudo-UTP(100mM)。

② 加帽RNA共转录体系

在冰上配制如下反应体系：

c. 帽子类似物与每种 NTP 的摩尔浓度之比应为 4 : 5，该摩尔比适用于CleanCap系列帽子类似物。帽子类似物可参考使用 Cap1 analogue AG。 若使用其它结构的帽子类似物，请根据帽子类似物的说明书设定帽子类似物与GTP的合理比例，可根据加帽效率调整比例，但两者终浓度之和控制在10 mM 为宜。

③ 非放射性标记RNA体外转录体系

d. 本体系适用生物素修饰UTP、荧光素修饰UTP、地高辛修饰UTP或者氨基烯丙基修饰UTP，使用修饰UTP转录产量会比未修饰UTP转录产量偏低。

注1：不同模板序列的转录效率差异较大，初次实验可先按照建议加入量进行，然后再摸索优化最适体系，模板量可在 0.5 μg~2 μg 的范围进行调整。

（2）充分混匀并瞬离后，37℃温育2 h。若转录产物长度＜100nt，，可延长反应时间至3~16 h。

（3）反应结束后，向产物中按照每μg Template DNA加入2 μl DNase I, RNase-free 的比例，37℃孵育15 min以去除 DNA 模板。

（4）转录后的RNA推荐用磁珠或者柱纯化，也可以采用酚/氯仿或者氯化锂纯化。纯化后的RNA可以进行下游实验或者储存于-80℃备用。

3. 对照模板转录（T包装不含）

对照模板是一个含有T7启动子的线性DNA片段，转录产物大小约4000 nt。在推荐的标准体外转录反应体系中，1 μg对照模板DNA 在37℃下反应2 h至少可获得150 μg以上的RNA。

4. 产物纯化：

转录后的 RNA 可以选用磁珠法进行纯化，也可以采用柱纯化、酚 / 氯仿纯化法或氯化锂沉淀法等，以去除蛋白、游离的核苷酸。纯化后的 RNA 经电泳检测后可进行下游实验或存储于-80℃。

(1) 磁珠纯化法

按照磁珠说明书进行纯化操作。

(2) 柱纯化法

纯化前加入80 μl Nuclease-Free Water 将产物稀释至 100 μl，再按纯化柱说明书进行纯化操作。

(3) 酚 / 氯仿纯化法

① 向20 μl反应混合物中，加入115 μl Nuclease-Free Water 和15 μl 3 M乙酸钠(pH5.2)，混合均匀。

② 加入等体积(150 μl)的酚/氯仿(1:1)混合液抽提一次，室温以最大转速（≥12000 rpm）离心5 min，将上层水相溶液转移至新的RNase-free EP管中。

注：转移上清时请勿吸到中间层。

③ 再加入等体积的氯仿抽提 2 次，收集上清，并转移至新的 RNase-free EP 管中。

④ 加入2倍体积的无水乙醇沉淀 RNA。混合均匀后置于-20℃至少 30 min，以最大转速（≥12000 rpm），4℃离心15 min，收集沉淀。

⑤ 加入500 μl冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀，以最大转速（≥12000 rpm）， 4℃离心5 min，收集沉淀。

⑥ 用20 μl Nuclease-Free Water 溶解RNA 沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。

(4) 氯化锂沉淀法

采用氯化锂沉淀法，RNA长度至少满足100 nt以上，且浓度不能低于100 ng/μl。

① 向20 μl反应混合物中，加入30 μl Nuclease-Free Water和30 μl 7.5 M氯化锂。

② 混合均匀后，置于-20℃至少30 min，以最大转速（≥12000 rpm），4℃ 离心15 min，收集沉淀。

③ 加入500 μl冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀，以最大转速（≥12000 rpm），4℃离心5 min，收集沉淀。

④ 用20 μl Nuclease-Free Water 溶解RNA 沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。

5. RNA 定量

(1) 紫外吸收法：

游离的NTP等会严重影响定量的准确性，采用此方法前请先进行RNA纯化。

(2) 染料法：

可使用RNA特异荧光染料或相关试剂盒进行RNA定量，可以对纯化或者未纯化的反应产物中的RNA进行定量。

6. RNA 检测

(1) 凝胶电泳法

为了评估转录本的长度及质量，转录产物应选择合适的非变性或变性琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测。变性电泳下可减少RNA的二级结构形成,通常RNA以正确大小的单个条带迁移。

注1：电泳缓冲液和凝胶均需现配现用，使用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时推荐用0.5× TBE电泳缓冲液电泳。

注2：转录完成的RNA可用Nuclease-Free Water稀释后电泳，电泳上样量推荐0.05~1 μg。

注3：加完RNA Loading Buffer后的样品可于65℃处理5~10 min以减少RNA二级结构形成。

注4：可使用Safe Red核酸染料观察RNA电泳条带，聚丙烯凝胶酰胺凝胶推荐用泡染法观察条带。

(2) 毛细管电泳法

毛细管电泳法可数字化的精确评估RNA样本的完整性、纯度或降解程度。与凝胶法相比，此法所需RNA样本量低，灵敏度高。

注意事项：

1.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

常见问题：

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