Poly(A) RNA聚合酶

Poly(A) RNA Polymerase

产品简介：

  Poly(A) Polymerase是一种来源于大肠杆菌的聚合酶，也称E.coli PAP、PAP酶、Poly(A)加尾酶或PolyA加尾酶，经大肠杆菌重组表达后纯化获得。Poly(A) Polymerase不依赖于模板，催化ATP转化为AMP并添加至单链RNA的3'端，形成多聚腺苷尾。Poly(A) Polymerase无法以DNA为底物，且不推荐使用双链RNA或过短的寡核苷酸（＜20 nt）为底物。Poly(A) Polymerase催化的Poly(A)加尾反应只能使用ATP，而不能使用ADP或dATP。使用CTP和UTP时，其掺入量不足使用ATP的5%；使用GTP时，完全不能添加到RNA的3'末端。

产品组成：

保存条件: 

-20℃保存，2年有效。

适用范围：

1. 在 RNA末端添加Poly(A)尾，用于后续克隆或纯化。

2. 提升mRNA在真核细胞中的翻译效率。

3. RNA 的 3' 末端标记。

4. cDNA 合成，为miRNA添加Poly(A)尾后逆转录获得cDNA。

活性定义:

1 活性单位(U)是指在20 µl反应体系中，37℃条件下，10 min 催化1 nmol的AMP掺入RNA所需要的酶量。

蛋白纯度检测：

使用SDS-PAGE凝胶电泳检测，蛋白纯度不低于95%。

非特异性内切酶活性：

37℃下，在20 μl反应体系中将5 U Poly(A) Polymerase与 200 ng 超螺旋质粒DNA共同温育4 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于 20%的质粒DNA转变成缺刻或线性状态。

DNase 活性：

37℃下，在20 μl反应体系中将5 U Poly(A) Polymerase与 15 ng 双链DNA片段共同温育16 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，双链 DNA片段无变化。

RNase 活性：

37℃下，在10 μl反应体系中将5 U Poly(A) Polymerase与 500 ng RNA共同温育1 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，超过90%的RNA 保持完整。

宿主DNA残留：

采用中国药典2020版四部通则3407外源性DNA残留量测定法第三法定量PCR法，本品中大肠杆菌宿主细胞DNA残留量。

使用方法：

1. 于冰上配制如下反应体系：

a. 为避免杂质影响加尾酶活性，应当使用纯化后的RNA；若RNA 3'端存在高级结构，建议对RNA进行预变性(65℃加热5 min，冰上放置5 min)后再进行加尾，避免影响加尾效果。

2. 37℃孵育30~60 min。加尾长度受酶量、ATP 浓度、反应时间等多个因素影响，可根据实际反应情况进行体系调整。

3. 按照以上反应体系，加Poly(A)尾长度可以超过100个碱基。

4. 加入EDTA至终浓度为10 mM或65℃孵育20 min终止反应。

注意事项：

1.      加尾长度受酶量、ATP浓度和反应时间等因素影响，一般本酶在37℃反应30 min可加约30个A碱基，60 min可加约100个A碱基。

2.      该酶将AMP添加到 RNA 的 3'末端具有较高的选择性，并不会在所有 RNA 分子中添加相同长度的 Poly (A)。

3.      加尾结束后，在转染细胞或显微注射前，必须对RNA进行纯化。

4.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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