T7 RNA聚合酶（高浓度）

T7 RNA Polymerase (HC)

产品简介：

  本产品是大肠杆菌重组表达来源的噬菌体T7 RNA聚合酶，是一种依赖DNA的RNA聚合酶，对噬菌体T7启动子序列具有高度特异性。T7 RNA聚合酶以含有T7启动子序列的双链DNA为模板，以NTP为底物，合成与启动子下游的单链DNA互补的RNA。

产品组成：

保存条件: 

-20℃保存，2年有效。

活性定义:

1 活性单位 (U) 是指在 37℃下，1 h 内使1 nmol ATP掺入酸不 溶物所需要的酶量。

内切酶活性：

37℃下，在20 μl T7 RNA Pol Buffer反应体系中将200 U T7 RNA Polymerase (HC)与200 ng超螺旋质粒DNA共同温育4 h后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于20%的质粒DNA转变成缺刻或线性状态。

DNase活性：

37℃下，在20 μl T7 RNA Pol Buffer反应体系中将200 U T7 RNA Polymerase (HC)与15 ng双链DNA片段共同温育16 h后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，双链DNA片段无变化。

RNase活性：

37℃下，在10 μl T7 RNA Pol Buffer反应体系中将200 U T7 RNA Polymerase (HC)与500 ng RNA共同温育1 h后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，不低于90%的RNA仍保持完整。

宿主DNA残留：

采用中国药典2020版四部通则3407外源性DNA残留量测定法第三法定量PCR法，本品中大肠杆菌宿主细胞DNA残留量低于10 拷贝/100 U。

使用方法：

1. 体外转录

① 在冰上配制如下反应体系：

a. 建议先加入Nuclease-Free Water, 然后再加入ATP/CTP/GTP/UTP.

b. 可以用同样摩尔浓度的修饰NTP替代相应的野生型。

② 充分混匀并瞬离后，37℃温育2 h。若转录产物长度＜300 nt，可延长反应时间至3~16 h。

③ 反应结束后，向产物中加入1~2 U DNase I-ST，37℃ 孵育15 min以去除DNA模板。 ④ 获得的mRNA经纯化，质检合格后用于后续实验或工艺。

2. 体外共转录

① 在冰上配制如下反应体系：

a. 建议先加入Nuclease-Free Water, 然后再加入ATP/CTP/GTP/UTP.

b. 可以用同样摩尔浓度的修饰NTP替代相应的野生型。

c. 帽子类似物与每种NTP的摩尔浓度之比应为4 : 5 。

② 充分混匀并瞬离后，37℃温育2~3 h。若转录产物长度＜300 nt，可延长反应时间至4~16 h。

③ 反应结束后，向产物中加入1~2 U DNase I-ST，37℃ 孵育15 min以去除DNA模板。 ④ 获得的mRNA经纯化，质检合格后用于后续实验或工艺。

注意事项：

1.      不同模板序列的转录效率差异较大，初次实验可先按照建议加入量进行，然后在调整范围内摸索优化最适体系。

2.      模板DNA可通过线性化环状质粒或PCR获得。模板DNA上游需含有T7启动子序列，下游为平末端或模板链5'末端突出。模板 DNA的纯度对体外转录反应至关重要，而质粒DNA抽提过程中引入的RNase A残留会显著影响转录RNA的质量，建议使用A260 /A280 为1.8~2.0的高纯度RNase-free模板。

3.      酶溶液中均含有甘油，建议体系中各种酶制品添加体积合计不应超过总反应体积的1/5。

4.      共转录反应速率一般为普通体外转录的1/5~1/2。

5.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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