钙黄绿素蓝（蓝色）

Calcein Blue, AM

【温馨提示】：见我司整理的Calcein 钙黄绿素（常用的活细胞荧光探针）专题，寻找最合适波长的钙黄绿素活细胞探针。

产品简介：

Calcein, AM，中文名钙黄绿素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一种具细胞膜渗透性最受欢迎的活细胞荧光染料，用来标记和监测活细胞功能，呈绿色荧光（Ex/Em= 490nm/515nm）。然而，Calcein, AM单一颜色使其不能将其用在多重标记实验，比如，其无法和GFP转染细胞联合使用，因光谱一致。为了解决这一应用缺陷，我司特别开发出Calcein Blue, AM、Calcein Red, AM等，实现联合Calcein, AM对活细胞的多重标记和功能分析。

Calcein Blue, AM本身仅呈微弱荧光（Ex/Em~322/435nm），具有细胞膜渗透性。一旦进入细胞后，被细胞内酯酶水解为钙黄绿素蓝（Calcein Blue），探针极性增强并能保留在细胞内数小时，此时荧光强度增强且荧光光谱迁移到更长波长（Ex/Em~360/445nm），光谱特征类似于DAPI、Hoechst 33342（CAT：NBS8032 和 CAT：NBS8033）或Hoechst 33258（CAT：NBS8034 和CAT：NBS8035）。

产品特性：

1）  CAS NO：168482-84-6

2）  化学名：N-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]-N-[(7-hydroxy-4-methyl-2-oxo-2H-1-benzopyran-8-yl) methyl]-glycine, (acetyloxy)methyl ester

3）  同义名：Calcein Blue Acetoxymethyl ester钙黄绿素蓝乙酰氧基甲酯；

4）  分子式：C₂₁H₂₃NO₁₁

5）  分子量：465.41

6）  纯度：≥90%

7）  Ex/Em：360/445nm

8）  溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

9）化学结构图：

保存条件: 

-20℃避光干燥保存，至少一年有效。

产品使用：

A， 储存液制备

储存液配制范围可为1～5 mM，具体根据工作浓度来决定，建议提前配制成1000×储存液。若使用的工作液为5μM，那么可配制5mM的储存液，即往1mg Calcein Blue, AM（Mw：465.41）内加入430μl 细胞培养级别的DMSO，充分溶解，混匀。储存液根据单次用量分装-20℃保存，避免反复冻融，数月稳定（不要超过6个月）。 

B， 20% Pluronic F-127制备【可选】

称取100mg Pluronic F-127（CAT NO. NBS2009）粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。 

C， 染色步骤

大多数实验体系中Calcein Blue, AM的工作浓度为2-5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein Blue, AM的最佳工作浓度，以最低的探针浓度得到最好的荧光结果为筛选原则。

1）  取一管适量分装的储存液（1000×）置于室温，至少回温20min，低速离心后，用合适的缓冲液如PBS，HBSS-HEPES稀释到1×染色工作液。

【注意】：有时可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F127到Calcein Blue, AM储存液内来增强其水溶性。制备染色工作液前，取一管Calcein Blue, AM储存液内加入等体积的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的终浓度为0.02%。加入Pluronic F127的Calcein Blue, AM溶液不可长期保存，需现配现用。

2）  对于贴壁细胞，先用胰酶-EDTA或Accutase消化细胞，离心收集细胞（1000 rpm，3min）。对于悬浮细胞，直接离心收集细胞。【注意】：贴壁细胞也可进行原位染色。

3）  去上清，用PBS（或者其他缓冲液）清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酯酶活性。

4）   用1/10细胞培养基体积的Calcein Blue, AM染色工作液重悬细胞，37℃孵育20min～1h。

【注意】：a）若细胞自身含有机阴离子转运体，需加入丙磺舒（CAT NO. NBS2007）（1-2.5mM）或者苯磺唑酮（0.1-0.25mM）到孵育体系内以降低去酯化的Calcein Blue泄露到胞外；

b）降低探针加载温度，可能会减少探针区室化现象。

5）  用PBS（或者其他缓冲液）洗涤细胞两次去除多余染料。

【注意】：如有必要，使用含有机阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗。

6）  用含合适滤光片（Ex/Em=360/445nm）的仪器进行检测。

注意事项：

1.      荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3.      Calcein Blue, AM对湿度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。Calcein Blue, AM储存液需要分装避光冻存，且必须紧紧密封盖子，干燥保存。Calcein Blue, AM工作液必须现配现用。

4.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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