钙黄绿素深红乙酰氧基甲酯

Calcein Deep Red AM

【温馨提示】：见我司整理的Calcein 钙黄绿素（常用的活细胞荧光探针）专题，寻找最合适波长的钙黄绿素活细胞探针。

产品简介：

Calcein, AM，中文名钙黄绿素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一种具细胞膜渗透性最受欢迎的活细胞荧光染料，用来标记和监测活细胞功能，呈绿色荧光（Ex/Em= 490nm/515nm）。然而，Calcein, AM单一颜色使其不能将其用在多重标记实验，比如，其无法和GFP转染细胞联合使用，因光谱一致。为了解决这一应用缺陷，我司特别开发出Calcein Red（CAT NO.：NBS2016），Calcein Deep Red（CAT NO.：NBS2019）这些衍生物，能够联合GFP或FITC等荧光素实现对活细胞的多重标记和功能分析。

钙黄绿素深红乙酰氧基甲酯（Calcein Deep Red AM）自身无荧光，具有细胞膜渗透性。能够轻易进入活细胞，被细胞内酯酶水解生成钙黄绿素深红（Calcein Deep Red），产生强烈的深红色荧光（Ex/Em=643/663nm），用标准的Cy5滤片设置检测。

产品特性:

1）  同义名：Calcein Deep Red AM；Calcein Deep Red AM Ester;钙黄绿素乙酰氧基甲酯（深红色），钙黄绿素深红乙酰氧基甲酯；

2）  分子量：~600

3）  纯度：≥95%（HPLC）

4）  Ex/Em：643/663nm

5）  溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

保存条件: 

-20℃干燥保存，避免强光直射，有效期一年。

应用实例:

Fig 1.HeLa细胞（活细胞+固定细胞）经Calcein Deep Red AM（CAT NO.：NBS2019）染色的图片。

产品使用：

1、储存液制备

储存液配制范围可为2～5 mM，具体根据工作浓度来决定，建议提前配制成1000×储存液。若使用的工作液为5μM，那么可配制5mM的储存液，即往1mg Calcein Deep RedAM（Mw ~600）内加入333μl细胞培养级别的DMSO即可。储存液需要根据单次用量分装，-20℃避光干燥保存，一定要避免受潮，此种情况下可稳定保存数月。

2、染色工作液制备

于正式实验前，或溶解Calcein Deep RedAM粉末配制储存液，或取一管已配制好的Calcein Deep RedAM储存液并回至室温使充分融化。用添加有2.5mM 丙磺舒（CAT NO. NBS2007）的HHBS（Hanks with 20mM Hepes buffer）或其他适当的缓冲液（pH 7.0）稀释储存液到5~10 µM工作浓度。

【注1：Calcein Deep Red染色工作液很不稳定，需要使用前配制。】

【注2：许多细胞都含有机阴离子转运体。因此高度推荐染色工作液内添加2.5mM丙磺舒（有机阴离子转运体抑制剂），以防止荧光探针泄露到细胞外。】

3、染色步骤

以下是基于96孔板的Calcein Deep Red活细胞染色步骤，仅作参考。具体实验请根据自身要求做调整。

a. 细胞准备：于黑框/透明底的96孔微孔板内按照100~10,000个细胞/孔的量铺板。设置空白孔（不含细胞的培养基）。【注意】：每种细胞系需要根据实际情况来确认细胞增殖或细胞毒性诱导的最佳细胞密度。增殖分析，细胞密度相对少些；毒性分析，起始细胞密度高些。建议96孔板的单孔体积为100 µL。

b. 药物处理：加待测药物到细胞内处理适当时间（比如24h，48h或96h）。设置空白孔（不含细胞的培养基），加入相应量的待测药物。【注意】：药物添加前可不用清洗细胞。然而，若是药物是血清敏感性，那在添加药物前需要吸掉生长培养基和血清因子。替换之细胞用无血清培养基培养。

c. 吸掉培养基。【注意】：探针加载前必须去除培养基。

d. 按照100 µL/孔（96孔板）的量加入Calcein Deep Red染色工作液。

e. 室温或37℃避光孵育1h。

【注意1】：适当的孵育时间取决于细胞类型和使用的细胞浓度。每个实验建议进行孵育时间优化。

【注意2】：对于悬浮细胞，探针孵育结束后，于800rpm离心2min。

f. 用含合适滤光片（Ex/Em= 643nm/663nm）的仪器进行荧光检测。【注意：如果荧光背景高，可在荧光信号检测前用含2.5mM丙磺舒的HHBS缓冲液替换Calcein Deep Red染色工作液。】

注意事项：

1.      荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3.      Calcein Red AM对湿度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。Calcein Red AM储存液需要分装避光冻存，且必须紧紧密封盖子，干燥保存。Calcein Red AM工作液必须现配现用。

4.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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