植物原生质体分离与转化试剂盒

Plant Protoplast Isolation and Transformation Kit

产品简介：

原生质体（Protoplast）是指植物细胞去掉细胞壁后的裸露部分，体外培养条件下，具有以下功能：1）具全能型，可再生细胞壁，进行连续的细胞分裂且能再生成完整植株的能力；2）具摄取外源大分子、细胞器，以及细菌、病毒的能力，从而原生质体是进行遗传操作，基因转移的良好材料；3）通过同种和异种植物的原生质体融合，可产生异核体，实现体细胞杂交，从而培育出具有抗病原或更高产量的新品种。

原生质体（Protoplast）的制备最主流的技术是酶解法，因其具有消化温柔，操作简单，且良好维持原生质体完整性的特点。工作原理是根据植物细胞壁的结构特征选择合适的酶进行处理，植物细胞壁主要由多糖（纤维素、半纤维素、果胶等）以及少量的蛋白和脂质构成。因此，通过使用纤维素酶、离析酶、半纤维素酶、果胶酶等复合酶来降解细胞壁，即可得到原生质体。

原生质体（Protoplast）的转化方法很多，主要有PEG介导转化法、电击穿孔转化法、脂质体介导转化法、农杆菌共培养转化法等。

本试剂盒利用的是PEG介导的原生质体转化法，操作简单和便捷。试剂盒含有植物原生质体制备（不包含消化酶）和植物转化需要的所有试剂。原生质体制备，按照单次5ml酶液体系来算，可做40次酶消化反应；原生质体转化，按照每次转化100μl原生质体溶液，可做至少40次转化。

保存条件: 

-20℃保存，1年有效。

产品组成：

产品使用：

一、需要准备材料

1.1  离析酶R-10（货号：NBS9032-1g）

1.2  纤维素酶R-10（货号：NBS9510-1g）

1.3  70μm细胞筛网

1.4  平头镊子

1.5  一次性刀片

1.6  1.5ml离心管

1.7  50ml离心管

1.8  恒温加热水浴锅

二、原生质体分离

2.1 按照以下表格体系，配制即用型酶溶液：【注意：此溶液现配现用】

2.2 取生长状态良好的叶片切成0.5-1mm的小条，按照20个叶片加10ml即用型酶溶液的比例迅速将切好的叶片小条浸泡于即用型酶溶液内，室温避光酶解3h。

【注意】：酶解时间与叶片类型、叶片生长状态有关，请根据实际实验进行调整。酶溶液变为绿色表明原生质体已经分离，显微镜镜检确定是否分离。

2.3 酶解后加入10ml溶液B，轻柔混匀。

2.4 用70μm细胞筛网过滤步骤2.3获得的溶液，去除未消化的叶片和杂质，收集滤液到50ml离心管内。

2.5 滤液于100×g，室温离心2min，吸掉上清。

2.6 加1ml溶液B重悬原生质体，冰浴30min，使得原生质体自然沉淀到底部。

2.7 小心吸掉上清，不要触动原生质体沉淀。将沉淀重悬于1ml溶液C，即得到原生质体溶液。

三、原生质体转化

3.1 取10μl质粒DNA（浓度为1-2μg/μl）于1.5ml离心管。

3.2 加入100μl原生质体溶液，轻柔混匀。

3.3 加入等体积（110μl）溶液D，轻柔完全混匀，室温孵育15min，间歇轻柔混匀。

3.4 加入2倍体积（440μl）溶液B，轻柔完全混匀，终止转化过程。

3.5 于100×g，室温离心2min，吸掉上清。

3.6 将沉淀重悬于1ml 溶液E中。

四、原生质体培养和收集

4.1 原生质体溶液室温孵育2-16h。

【注意】：根据特定实验确定孵育时间。RNA分析一般孵育2-6h；酶活性分析和蛋白标记一般孵育2-16h。

4.2 于100×g，室温离心2min收集原生质体，去掉大部分上清。

4.3 原生质体沉淀重悬于剩余溶液中，-80℃保存。

注意事项：

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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