水稻原生质体制备与转化试剂盒

Rice Protoplasts Preparation and Transformation Kit

产品简介：

植物原生质体是指去除掉细胞壁后由细胞膜包被的具有生命活力的植物细胞体。本试剂盒通过酶解法消化水稻幼苗的细胞壁，分离原生质体。获得的原生质体可以用于亚细胞定位、转录因子的调控、蛋白活性分析以及蛋白与蛋白相互作用等方面的研究。

本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，每次制备的原生质可支持20个以上的转化反应。

产品特点：

1.      高活高得率：酶解体系精准优化，原生质体形态完整、活性高，得率稳定有保障，为高效转化筑牢基础。

2.      转化效率优：专用转化液适配水稻特性，阳性对照转化效≥50%，荧光信号清晰，实验结果稳定可重复。

3.      一站式即用：涵盖从原生质体制备到PEG介导转化全流程预配试剂，无需复杂自制，新手也能快速上手。

保存条件: 

按照说明书温度保存，1年有效。

产品组成：

产品使用：

1．自备实验仪器与耗材：

低温水平离心机；水浴锅；0.45μm针头滤器；50ml圆底离心管；2ml圆底离心管；去尖的灭菌蓝枪头和黄枪头；

2．酶解液配制（当天制备）

注：

1．酶解液必须现配现用；

2．培养液CS和重悬液RS使用前需冰上预冷；

3．转化液TS若出现结晶，65℃水浴完全溶解后，冷却至室温待用。

3. 原生质体的制备

1. 将培养7-14天的无菌苗取出10-40株，截取茎和叶鞘部分（约1g，视生长状态而定），用锋利的刀片垂直生长方向快速切割叶鞘成0.5mm左右的小段，越细越好，不要撕扯。

注：建议使用无菌黄化苗，效果更佳；若使用土培苗，需用无菌水充分冲洗擦干后使用。

2．将切好的小段放入装有10ml酶解液的50ml三角瓶中（或细胞培养皿中），用锡纸包裹，瓶口留口，抽真空30min（15Hg/50kpa/0.5）。

3．避光28℃，60rpm摇床孵育4-5h。最后2min提高转速到100rpm，释放原生质体。此时可以取一滴进行镜检，如果细胞圆而发亮，则健康，继续往下做；如果细胞扁且发黑，则弃去。

4．酶解结束前准备：细胞筛卡在在圆底50ml离心管口，用1ml培养液CS润洗细胞筛后，弃废液待用；4℃预冷离心机，加速、减速加速度设置为3，转速150g。

5．酶解结束后，向三角瓶中缓缓加入与酶解液等体积的培养液CS，适当用力摇10s，将酶解液混匀释放原生质体，酶解产物用细胞筛过滤；用适量的培养液CS冲洗三角瓶中剩余的酶解产物到细胞筛过滤；最后用镊子或枪头轻轻挤压酶解物以充分释放原生质体，再用适量的培养液CS冲洗细胞筛几次，最后的滤液体积不要超过离心管容量。

6．选用水平转子。配平后，150g离心5min，加速、减速加速度为3。

7．小心拿出离心管，用1ml去尖枪头小心吸走上清，也可以使用电动移液器或台泵（把速度调的稍低一点，小心吸取，切勿碰到原生质体）。管底沉淀即为原生质体。

8．缓缓加入4ml培养液CS，将离心管沿竖直方向，左右倾斜至45°角，缓慢晃动使原生质体重悬。冰浴30min，同时取样按第9步镜检计数。

9．镜检计数

如下图所示，在血球计数板上加上一个盖玻片，分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区域长和宽都是1mm的方形区域进行计数（25个中方格）。分别统计正方形四个顶角和中央的小正方形的细胞数量，取平均值再乘以25（正方形被分成了25个小正方形），计算该区域的细胞数量，该区域的体积为0.1μl（长1mm，宽1mm，高0.1mm）。计算获得的细胞数量。原生质体浓度（个/ml）=25个中方格原生质体数×10⁴×稀释倍数。

10．30min后，原生质体将自然沉降于管底。若沉降不彻底，可采用150g离心2min，升降加速度均设为3。小心吸去上清，缓慢加入重悬液RS，重悬原生质体，确保原生质体密度为2×10⁵/ml以上（加入重悬液的体积=100μl×转化数，并多预留200μl）。

4. 原生质体的转化

1．在冰浴期间准备：在2ml灭菌圆底离心管中加入体积10μl、总量2-10μg的质粒（建议使用去内毒素质粒；体积不足用无菌ddH₂O补足；大的质粒，则用10μg，比如GFP融合质粒）。

2．向2ml离心管中（已加入10μl质粒）加入100μl重悬后的原生质体，轻轻拍打混匀。

3．加入110μl转化液TS，轻轻拍打混匀并计时，室温避光孵育15min。

注：原生质体和转化液较难混匀，请耐心拍打，直至充分混匀。

4．孵育结束后，缓缓加入440μl培养液CS，立即轻柔上下颠倒混匀以终止转化反应。

5．将离心机转头换成2ml的小转头，150g离心3min，加速、减速加速度为3。在不损失原生质体的情况下，用200μl枪头尽可能吸走上清。

6．加入1ml培养液CS，轻轻拍打重悬原生质体。150g离心3min，加速、减速加速度为3。小心吸走上清。

7．加入1ml培养液CS，轻轻混匀后平置离心管，28℃（或室温）暗培养12-16hrs（不要短于8 hrs或者超过24 hrs，最好8-16 hrs之内）。

8．培养结束后，缓慢拿起离心管，轻轻拍打重悬原生质体，离心管室温垂直，静置3min后再离心，150g离心3min，加速、减速加速度为3，去除大部分培养液，仅留底部100μl，用于后续实验。用去尖黄枪头吸取10μl滴在载玻片上观察（每次吸取观察前，轻轻拍打混匀，因为重力作用，大部分原生质体有可能会沉淀在底部）。

注意事项：

1.      分离细胞壁后的原生质体非常脆弱，整个实验操作过程需要尽可能温柔的操作。

2.      离心时为了避免与管壁摩擦导致原生质体破裂，建议使用水平转子。若无水平转子，适当调整离心力和离心时间等参数。

3.      实验中使用去尖的枪头，避免原生质体破裂。

4.      转化时推荐添加阳性对照。

5.      培养液CS和重悬液RS容易被微生物污染，建议适当分装后使用；或者开盖后置于4℃放置。如果溶液出现絮状物等污染，少量污染可以用0.22μm过滤器过滤后使用，大量污染丢弃。

6.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

实验数据：

1. 使用本试剂盒处理水稻黄化苗获得的原生质体效果图

图：取生长10 day的水稻黄化苗叶鞘部分(1g)，经过酶解、过滤后，取少量滤液在光学显微镜下观察游离的原生质体见上图。

2. 使用本试剂盒处理获得的水稻原生质体转化效果图

图：将7μg去内毒素的pB121-eGFP，转入水稻原生质体，图左为明场，图右为荧光。

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