pH荧光探针（红600, SE）

产品简介：

pH Red荧光染料展现出独特的pH依赖性荧光特性。与大多数在碱性条件下荧光更强的传统染料不同，该染料在酸性环境中荧光信号会显著增强。当pH值从中性降至酸性范围时，其荧光强度呈现急剧上升的趋势

pH Red在细胞外仅表现出微弱荧光，这一特性使得实验过程中可能无需洗涤步骤，大大简化了操作流程。pH Red染料为监测内体、溶酶体等酸性细胞区室提供了强有力的研究工具。虽然它在细胞外荧光较弱，但在吞噬体、溶酶体和内体等酸性环境中荧光会显著增强。这种特性使pH Red能够特异性地检测细胞内的酸性区室，同时降低信号变异，显著提高了成像和流式检测的准确性。此外，该染料还可与GFP、Fluo-8、钙黄绿素或FITC标记抗体等绿色荧光染料配合使用，实现细胞多功能分析。

pH Red 600，SE（琥珀酰亚胺酯衍生物）可轻松与各类生物分子偶联，用于成像或流式检测，实现对吞噬作用和内吞作用的 高精度、低变异 特异性检测。这些偶联物同样适用于与绿色荧光染料（如GFP、Fluo-8、钙黄绿素或FITC标记抗体）联用，进行多功能细胞分析。

产品特性：

1)     分子量：953.06

2)     外观：黑色固体

3)     溶解度：在DMSO中溶解

4)     Ex(nm)：576

5)     Em(nm)：579

pH荧光探针（红600）的pH依赖性发射光谱

保存条件: 

-20℃避光保存，2年有效。

产品使用：（仅供参考）

一、储备液的配制

（所有未使用的储存液应在配制后分装成单次使用量，并于-20°C保存。避免反复冻融。）

1. 蛋白储存液（溶液A）

将100 µL反应缓冲液（如1M碳酸钠溶液或pH~9.0的1M磷酸盐缓冲液）与900 µL目标蛋白溶液（如抗体，蛋白浓度建议>2 mg/mL）混合，配制1 mL蛋白标记储存液。

注意：

a)     蛋白溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。若pH低于8.0，需使用1M碳酸氢钠溶液或pH 9.0的1M磷酸盐缓冲液调节至8.0-9.0范围。 

b)     蛋白应溶解于1X磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2-7.4）中。若蛋白溶解于Tris或甘氨酸缓冲液，必须用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析以去除游离胺类或铵盐（如硫酸铵、醋酸铵等蛋白沉淀常用试剂）。

c)      含杂质抗体或用牛血清白蛋白（BSA）、明胶稳定的抗体标记效果不佳。叠氮化钠或硫柳汞可能干扰偶联反应，建议通过透析或离心柱去除以获得最佳标记效果。

d)     蛋白浓度低于2 mg/mL会显著降低偶联效率，推荐最终蛋白浓度为2-10 mg/mL。

2. pH Red 600，SE储存液（溶液B）

向pH Red 600，SE瓶中加入无水DMSO，配制10 mM储存液，通过移液或涡旋混匀。

注意：

a)     溶液B需在偶联反应前新鲜配制并立即使用。长期储存可能导致染料活性下降。 

b)     避光防潮条件下，溶液B可于冷冻保存两周，但需避免反复冻融。

二、标记步骤

1. 标记反应（以标记山羊抗小鼠IgG为例）

本操作方案专为pH Red 600，SE与山羊抗小鼠IgG的偶联反应而设计。针对其他特定蛋白可能需另行优化。

注意： 每种蛋白所需染料/蛋白比例各异，该比例还取决于染料特性。过量标记会损害蛋白结合活性，而标记比例过低则会导致检测灵敏度下降。

2. 进行偶联反应

a)     建议以10:1摩尔比（溶液B染料/溶液A蛋白），取95 µL蛋白溶液（溶液A，假设蛋白浓度为10 mg/mL，分子量~200 KD，则蛋白浓度约0.05 mM）加入5 µL染料储存液（溶液B，10 mM），充分振荡混匀

b)     若10:1比例效果不佳，可测试5:1、15:1及20:1等不同比例以确定最佳标记条件。

c)      室温下持续旋转或振荡反应混合物30-60分钟。

3. 偶联物纯化（以使用SephadexG-25柱纯化染料-蛋白质结合物为例）

a)     根据制造商说明书准备SephadexG-25柱。

b)     将上述反应混合物装载到SephadexG-25柱的顶部。

c)      当样品刚好流到顶部树脂表面下方时，立即添加PBS（pH7.2-7.4）。

d)     向所需样品中添加更多PBS(pH7.2-7.4) 以完成柱纯化。将含有染料-蛋白质结合物的各部分混合在 一起。

注意：若要立即使用，染料-蛋白质结合物需要用染色缓冲液稀释，分装后使用；若要长期保存，染料-蛋白质结合物溶 液需要浓缩或冷冻干燥处理。

实验结果：

图：用pH Red 600，SE染色的活 Jurkat 细胞图像。活 Jurkat 细胞用 HHBS 洗涤两次，然后用10 µM pH Red 600，SE染色30分钟。随后，细胞再次用 HHBS 洗涤，并重悬于 pH 4.5 缓冲液或 pH 7.2 缓冲液中。图像在配有 TRITC 滤光片的荧光显微镜下拍摄。

注意事项：

1.      荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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