pH荧光探针（绿500, SE）

产品简介：

pH荧光探针是一种pH敏感型荧光染料，其荧光强度随环境pH值变化而显著改变。染料在细胞外不发荧光，在酸性室（如吞噬体、溶酶体和内体）中荧光信号显著增强，而在中性或碱性环境中，荧光较弱。pH荧光探针使得能够特异性检测细胞酸性室，从而在成像或流式分析中降低信号变异性并提高准确性。

产品特性：

1)     分子量：539.54

2)     外观：橙色固体

3)     溶解度：在DMSO中溶解

4)     Ex(nm)：445

5)     Em(nm)：503

pH Green 500荧光探针的pH依赖性发射光谱

保存条件: 

-20℃避光保存，2年有效。

产品使用：（仅供参考）

一、储备液的配制

以下配制好的储备液请按照每次实验用量进行分装，并储存在-20℃，避免反复冻融。

1. 蛋白质标记储备液（溶液A）

将100µL反应缓冲液（例如：pH值~9.0的1M碳酸钠溶液或1M磷酸盐缓冲液）与900µL目标蛋白质溶液（例如：浓度>2mg/mL的抗体、蛋白）混合，得到1mL蛋白质标记储备液（溶液A）。

【注意】

a)     蛋白质标记储备液（溶液A）的pH应为8.5±0.5。如果溶液A的pH值低于8.0，请使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH9.0磷酸盐缓冲液将pH值调节至8.0-9.0范围。

b)     蛋白质应溶解在1×磷酸盐缓冲液(PBS)（pH7.2-7.4）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用1×PBS（pH7.2-7.4）进行透析，去除用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和醋酸铵）。

c)      不纯的抗体或用牛血清白蛋白(BSA)或明胶稳定的抗体标记效果不好。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰标记反应，叠氮化钠或硫柳汞可通过透析或离心柱去除，以获得最佳标记结果。

d)     如果目标蛋白质浓度低于2mg/mL，结合效率会降低。为了获得最佳标记效率，建议目标蛋白质浓度范围为2-10mg/mL。

2. pH Green SE储备液（溶液B）

将无水DMSO加入到pH Green SE中，制成10mM储备溶液（溶液B），通过吹打或涡旋充分混合。

【注意】溶液B请尽量现配现用，在避光防潮条件下，溶液B可在-20℃保存两周，避免反复冻融。

二、标记步骤

1. 标记反应（以标记山羊抗小鼠IgG为例）

【注意】每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的特性。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质结合物会降低其灵敏度。

a)     使用摩尔比为10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）作为起始条件：将5µL溶液B（假设其染料浓度10mM）加入到装有95µL溶液 A的离心管中，并充分摇匀。假设蛋白质浓度为10mg/mL，蛋白质的分子量为~200KD，则蛋白质浓度为~0.05mM。

【注意】我们建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）摩尔比为10:1的溶液。如果比例太低或太高，则请分别在5:1、15:1 和20:1的摩尔比条件下，确定最佳染料/蛋白质比例。

b)     继续在室温下搅拌或摇动反应混合物30-60分钟。

2. 纯化（以使用SephadexG-25柱纯化染料-蛋白质结合物为例）

a)     根据制造商说明书准备SephadexG-25柱。

b)     将上述反应混合物装载到SephadexG-25柱的顶部。

c)      当样品刚好流到顶部树脂表面下方时，立即添加PBS（pH7.2-7.4）。

d)     向所需样品中添加更多PBS(pH7.2-7.4) 以完成柱纯化。将含有染料-蛋白质结合物的各部分混合在一起。

【注意】若要立即使用，染料-蛋白质结合物需要用染色缓冲液稀释，分装后使用；若要长期保存，染料-蛋白质结合物溶液需要浓缩或冷冻干燥处理。

注意事项：

1.      荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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