Zeocin Solution 博莱霉素溶液（100 mg/ml）

产品简介：

Zeocin是博来霉素/腐草霉素（bleomycin/phleomycin）抗生素家族的成员之一，从轮枝链霉菌Streptomyces verticillus中分离得到。作用谱广泛，对细菌、真菌（包括酵母菌）、植物和哺乳动物细胞具很强的毒性。

Zeocin是腐草霉素D1的商业名称，一种碱性、水溶性、铜离子螯合的糖肽抗生素。铜离子的存在使得溶液为蓝色，此铜螯合的形式为无活性。当抗生素进入细胞后，二价铜离子（Cu2+）被还原为一价铜离子（Cu+），并被细胞内的巯基化合物去除。铜离子被去除后，Zeocin被活化，嵌入DNA使其断裂，最终导致细胞死亡。来自Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因赋予Zeocin抗性，该基因编码一种13,665Da大小的蛋白，以化学计量方式结合Zeocin，抑制其DNA双链切割活性。因此，能表达此蛋白的真核和原核宿主细胞被赋予Zeocin抗性。

Phleomycin (腐草霉素) (货号：NBS2094)也是博来霉素家族的糖肽抗生素，其有效成分和Zeocin (博莱霉素)基本一致，都为Phleomycin D1，抗性基因也都为Sh ble。两者的配方有一定的区别，Zeocin是以Phleomycin D1为主要成分的一种试剂，添加了不同的辅料，更适用于哺乳动物细胞的筛选；而Phleomycin是结构相似抗生素的混合物，它们的末端氨基有一定的区别，建议用于对Zeocin不敏感的细胞，如丝状真菌和一些酵母等。

本品为溶于去离子水的无菌溶液，浓度为100mg/ml，细胞培养级别。

产品特性：

1）CAS NO.：11006-33-0

2）化学式：C55H83N19O21S2Cu

3）分子量：1137.41 g/mol

4）外观：蓝色溶液（100mg/ml in deionized，autoclaved water）

保存条件: 

-20℃避光保存，至少1年有效，避免反复冻融。

建议工作浓度：

1）大肠杆菌筛选：25-50μg/mL（低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L）

2）酵母菌筛选：50-300μg/mL（YPD或基本培养基）

3）哺乳动物细胞筛选：50-1000μg/mL（合适培养基，根据细胞系而不同）

操作步骤（以哺乳动物细胞为例）

【注1】：Zeocin的杀灭机制不同于新生霉素（neomycin）和潮霉素B（hygromycin B），细胞不会聚集成团和从培养板表面脱落。一旦接触到Zeocin，敏感细胞会出现如下的形态变化：1）细胞体积明显增加（类似于巨细胞病毒感染容纳性细胞引起的肿大效应）；2）异常的细胞形状包括细胞长臂（long appendages）出现；3）胞浆内出现大型空泡（源于内质网、高尔基体或支撑蛋白的破裂）；4）质膜和核膜破裂，导致膜上出现许多孔。这些敏感细胞最终会完全破损，仅仅以细胞碎片的形式存在。

【注2】：Zeocin抗性细胞按正常周期分化产生不同于敏感细胞的克隆。抗性细胞在形态上，与未接触Zeocin的正常细胞没有任何差异。

【注3】：Zeocin用于哺乳动物细胞筛选常用浓度为50-1000µg/ml（平均常用浓度为250-400μg/mL），影响筛选浓度的主要因素包括离子强度，细胞类型，细胞密度以及生长速率。以下步骤仅作参考，请根据自身实验体系做适当调整。

一、细胞对Zeocin敏感性的确定（杀灭曲线建立）

1）重新铺板或者将满盘细胞重新分盘，使得细胞密度约25%，按照8个平板/组准备，培养24h，去除旧培养基。

2）加入含不同浓度Zeocin的筛选培养基，Zeocin浓度可设置为0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000 μg/ml，每个浓度做3个平行；也可根据自身实验体系，设置不同的浓度梯度。

3）每3-4天更换新鲜的筛选培养基，并观察存活细胞的比例。选择在合适时间（1-2周内）杀死大多数细胞的浓度为最佳工作浓度。【注】：若是难以在显微观察下区分活细胞，建议使用台盼蓝染色来计算存活细胞的数量，以确定Zeocin的最适浓度。

二、筛选稳定转染细胞系

1）转染细胞，用100mm培养皿进行培养。以未转染的细胞作为阴性对照。

2）转染后，用预热的1X PBS洗涤一次，加入新鲜培养基。

3）转染48-72h后，用含有最佳浓度Zeocin（由灭杀曲线确定）的新鲜培养基筛选细胞。为了更好的鉴定和筛选细胞集落，建议将细胞按比例稀释成一系列浓度。

【注】：若待筛选细胞对Zeocin的抗性明显强于大部分细胞，按照以下方法克服此类耐性：用含Zeocin培养基进行细胞分盘，置于37°C孵育2-3h，使得细胞贴壁。然后将细胞置于4°C，2h。记得使用Hepes作为培养基的缓冲体系。重新将细胞置于37°C孵育。4°C孵育细胞的目的是短时间内终止细胞分化，使得Zeocin能发挥作用，杀死细胞。

4）每3-4天更换新鲜的选择培养基，直到出现细胞集落。

5）挑选并转移克隆到96或48孔板中。在进行更大孔径培养板或培养皿上扩大培养之前，确保培养细胞密度近100%。

三、稳定转染细胞系的维持培养

可采取以下方式维持培养稳定转染细胞：

1）使用含相同剂量Zeocin的筛选培养基来维持培养；

2）降低Zeocin剂量为原来的一半进行维持培养；

3）使用正好能预防敏感细胞生长但不足以致死的Zeocin剂量来维持培养【根据杀灭曲线来判断】；

Zeocin常用的工作浓度为100μg/ml，但是，最佳的工作浓度需要根据细胞类型和实际的实验体系来确定。某些哺乳动物细胞的建议工作浓度列在下表：

注意事项：

1.      Zeocin对光敏感，需将抗生素，或含该抗生素的平板或培养基置于黑暗处。

2.      降低细菌培养基的盐浓度，调整pH到7.5使其保持活性，因高离子强度和酸或碱性都会抑制Zeocin活性。

3.      储存Zeocin在-30°C~-10°C，使用前需冰上融化。

4.      Zeocin有毒，操作时需注意防护，切勿与身体或皮肤直接接触。

5.      Zeocin™是Invivogen公司的商标产品。

6.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

常用筛选抗生素及其使用浓度: