Zeocin (Powder) 博莱霉素（粉末）

产品简介：

Zeocin是一种作用于真核和原核细胞的选择性抗生素。来自Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因赋予Zeocin抗性，该基因编码一种13,665Da大小的蛋白，以化学计量方式结合Zeocin，抑制其DNA双链切割活性。因此，能表达此蛋白的真核和原核宿主细胞具有Zeocin抗性。

Zeocin是腐草霉素D1（Phleomycin D1）的商业名称，是一种铜离子螯合的糖肽抗生素（来源于链霉菌Streptomyces verticillus的突变株），铜离子的存在使其呈蓝色，此铜螯合的形式为无活性。当抗生素进入细胞后，二价铜离子（Cu2+）被还原为一价铜离子（Cu+），并被细胞内的巯基化合物去除。铜离子被去除后，Zeocin被活化，嵌入DNA使其断裂，最终导致细胞死亡。Zeocin作用谱广泛，对细菌、真核微生物、植物和哺乳动物细胞具很强的毒性。

Phleomycin (腐草霉素) (货号：NBS2094)也是博来霉素家族的糖肽抗生素，其有效成分和Zeocin (博莱霉素)基本一致，都为Phleomycin D1，抗性基因也都为Sh ble。两者的配方有一定的区别，Zeocin是以Phleomycin D1为主要成分的一种试剂，添加了不同的辅料，更适用于哺乳动物细胞的筛选；而Phleomycin是结构相似抗生素的混合物，它们的末端氨基有一定的区别，建议用于对Zeocin不敏感的细胞，如丝状真菌和一些酵母等。

Zeocin对于绝大多数好氧细胞均有效，常用于细菌(如大肠杆菌)、真核微生物(如酵母)及动植物细胞的筛选。大肠杆菌筛选推荐浓度为25~50μg/ml (低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L)；酵母筛选推荐浓度为50~300μg/ml (YPD或基本培养基)；哺乳动物细胞筛选推荐浓度为50~1000μg/ml (根据细胞类型选择合适的细胞培养液)。实际应用时，应针对不同的细胞系测试Zeocin的浓度梯度，以确定最佳使用浓度。

产品特性：

1） CAS NO.：11006-33-0

2） 外观：蓝色

3） 内毒素：＜1 EU/mg

4） 溶解性：易溶于水（>500 mg/ml）

5） 质量控制：分别对Zeocin敏感或Zeocin耐性的哺乳动物细胞测定抗生素活性。

保存条件: 

4℃干燥保存（一年有效）。

母液制备

1）将低温保存的Zeocin置于室温回温至少20min，加入适量HEPES buffer（5g/L, pH 7.2±0.1），充分溶解，配制成100mg/ml溶液。

2）用0.22µm滤膜过滤除菌。

3）溶液置于4℃保存12个月有效，或-20℃保存，18个月有效。

操作步骤（以哺乳动物细胞为例）

【注1】：Zeocin的杀灭机制不同于新生霉素（neomycin）和潮霉素B（hygromycin B），细胞不会聚集成团和从培养板表面脱落。一旦接触到Zeocin，敏感细胞会出现如下的形态变化：1）细胞体积明显增加（类似于巨细胞病毒感染容纳性细胞引起的肿大效应）；2）异常的细胞形状包括细胞长臂（long appendages）出现；3）胞浆内出现大型空泡（源于内质网、高尔基体或支撑蛋白的破裂）；4）质膜和核膜破裂，导致膜上出现许多孔。这些敏感细胞最终会完全破损，仅仅以细胞碎片的形式存在。

【注2】：Zeocin抗性细胞按正常周期分化产生不同于敏感细胞的克隆。抗性细胞在形态上，与未接触Zeocin的正常细胞没有任何差异。

【注3】：Zeocin用于哺乳动物细胞筛选常用浓度为50-1000µg/ml（平均常用浓度为250-400μg/mL），影响筛选浓度的主要因素包括离子强度，细胞类型，细胞密度以及生长速率。以下步骤仅作参考，请根据自身实验体系做适当调整。

一、细胞对Zeocin敏感性的确定（杀灭曲线建立）

1) 重新铺板或者将满盘细胞重新分盘，使得细胞密度约25%，按照8个平板/组准备，培养24h，去除旧培养基。

2) 加入含不同浓度Zeocin的筛选培养基，Zeocin浓度可设置为0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000 μg/ml，每个浓度做3个平行；也可根据自身实验体系，设置不同的浓度梯度。

3) 每3-4天更换新鲜的筛选培养基，并观察存活细胞的比例。选择在合适时间（1-2周内）杀死大多数细胞的浓度为最佳工作浓度。【注】：若是难以在显微观察下区分活细胞，建议使用台盼蓝染色来计算存活细胞的数量，以确定Zeocin的最适浓度。

二、筛选稳定转染细胞系

1) 转染细胞，用100mm培养皿进行培养。以未转染的细胞作为阴性对照。

2) 转染后，用预热的1X PBS洗涤一次，加入新鲜培养基。

3) 转染48-72h后，用含有最佳浓度Zeocin（由灭杀曲线确定）的新鲜培养基筛选细胞。为了更好的鉴定和筛选细胞集落，建议将细胞按比例稀释成一系列浓度。

【注】：若待筛选细胞对Zeocin的抗性明显强于大部分细胞，按照以下方法克服此类耐性：用含Zeocin培养基进行细胞分盘，置于37°C孵育2-3h，使得细胞贴壁。然后将细胞置于4°C，2h。记得使用Hepes作为培养基的缓冲体系。重新将细胞置于37°C孵育。4°C孵育细胞的目的是短时间内终止细胞分化，使得Zeocin能发挥作用，杀死细胞。

4) 每3-4天更换新鲜的选择培养基，直到出现细胞集落。

5) 挑选并转移克隆到96或48孔板中。在进行更大孔径培养板或培养皿上扩大培养之前，确保培养细胞密度近100%。

三、稳定转染细胞系的维持培养

可采取以下方式维持培养稳定转染细胞：

1）使用含相同剂量Zeocin的筛选培养基来维持培养；

2）降低Zeocin剂量为原来的一半进行维持培养；

3）使用正好能预防敏感细胞生长但不足以致死的Zeocin剂量来维持培养【根据杀灭曲线来判断】。

Zeocin常用的工作浓度为100μg/ml，但是，最佳的工作浓度需要根据细胞类型和实际的实验体系来确定。某些哺乳动物细胞的建议工作浓度列在下表：

注意事项：

1.      Zeocin粉末容易受潮，一定要注意干燥保存。每一次使用完后需盖紧管子。

2.      Zeocin是一种不稳定化合物，在高pH和低pH或存在弱氧化剂的情况下会发生不可逆变性。

3.      Zeocin对高浓度酸和碱都很敏感，但短期暴露在弱酸下能耐受。

4.      Zeocin对光敏感，需将抗生素，或含该抗生素的平板或培养基置于黑暗处。

5.      Zeocin有毒，操作时需注意防护，切勿与身体或皮肤直接接触。

6.      Zeocin™是Invivogen公司的商标产品。

7.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

常用筛选抗生素及其使用浓度: