活性氧（ROS）荧光探针

H2DCFDA (DCFH-DA)
 

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产品简介：

H2DCFDA（DCFH-DA），英文全称为 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，中文全称为 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯，是一种常用的氧化应激指示剂。该探针具有细胞膜通透性，本身无荧光。进入细胞后，被胞内酯酶水解生成 2',7'-二氯二氢荧光素（2',7'-Dichlorodihydrofluorescein, DCFH），随后被活性氧快速氧化为强荧光产物 2',7'-二氯荧光素（2',7'-Dichlorofluorescein, DCF），可通过荧光光谱法检测（Ex/Em = 504/529 nm）。

本品主要用于检测活性氧（ROS）及评估细胞总氧化应激水平，广泛应用于细胞氧化还原状态的研究。本品以粉末形式提供，可直接溶于无水 DMSO 配制成 1–10 mM 储存液；常用工作浓度为 1–10 μM，具体浓度需根据实验体系或参考文献进行优化。

对于样本量有限、注重操作简便性的实验场景，建议选用我司活性氧检测试剂盒（货号 NBS6701）。该试剂盒除荧光探针 H2DCFDA 外，还配套阳性对照，可有效简化实验流程。

化学信息：

1)     CAS NO.：4091-99-0

2)     化学名：Benzoic acid, 2-(3,6-bis(acetyloxy)-2,7-dichloro-9H-xanthen-9-yl)
2-(3,6-diacetoxy-2,7-dichloro-9H-xanthen-9-yl)benzoic acid

3)     英文同义名：DCFH-DA；2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate；2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate

4)     中文同义名：2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯；2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯

5)     分子式：C₂₄H₁₆Cl₂O₇

6)     分子量：487.29

7)     纯度：≥97%

8)     外观：白色至带黄色光泽的白色粉末

9)     溶解性：溶于DMSO（25 mg/ml）、DMF（25 mg/ml）、无水乙醇（25 mg/ml）

保存条件: 

-20℃保存（两年有效）

产品使用（需根据具体应用场景及检测灵敏度进行优化调整）：

1.     储存液配制

将低温保存的冻干粉恢复至室温，低速离心使粉末聚集于瓶底。加入适量无水 DMSO 或其他有机溶剂，配制成 1–10 mM 储存液。未用完的储存液需分装、避光，于 -20℃ 冻存，避免反复冻融。

2.     工作液配制

正式实验前，用生理缓冲液（如 PBS、HBSS、HEPES 缓冲液）将储存液稀释至 1–10 μM 工作浓度。具体浓度需根据实验体系优化确定。

3.     细胞染色

吸去培养液，加入步骤 2 配制的工作液，于 37℃（或根据细胞类型调整）孵育 5–60 min。

4.     去酯化与平衡

吸去染色工作液，用预热的生理缓冲液或培养液清洗细胞。重新加入预热的缓冲液或培养液，于适宜温度下继续孵育。二乙酸酯类探针需经胞内酯酶水解（去酯化）后才能响应氧化应激。最佳去酯化时间因细胞类型而异，某些细胞酯酶活性较低，需适当延长孵育时间。

5.     基线测定

在加入实验刺激物前，测定已加载细胞的背景荧光强度作为基线。

6.     阴性对照设置

按以下要求评估阴性对照：

1)     在绿色通道（绿色发射光谱范围）内检测未染色细胞的自发荧光；

2)     流式分析时，确认染料加载及处理后细胞的前向角散射（FSC）和侧向角散射（SSC）无明显变化（细胞尺寸改变可能提示处理毒性导致的起泡或萎缩）；

3)     对含或不含刺激物的无细胞染料-缓冲液/培养基混合物进行荧光检测。在无细胞体系中，若随时间推移荧光逐渐增强，可能源于探针自发水解、空气氧化或光诱导氧化；

4)     检测培养于生长培养基或简单缓冲液中的未处理、已加载染料细胞的荧光。健康细胞内的酶系及天然抗氧化剂可清除 ROS，经去酯化后应呈现较低且稳定的荧光信号。若自发出现强荧光，提示细胞死亡或其他氧化应激事件。

7.     阳性对照设置

可采用以下方式诱导氧化应激：

1)     PKC 激活剂 / 佛波酯类（如 PMA，常用浓度 10 nM–1 μM）；

2)     H₂O₂ 或 TBHP（终浓度约 100 μM，根据细胞敏感性调整）。

8.     光谱干扰排查

确保刺激物/受试化合物不会通过内滤效应或荧光淬灭干扰检测。核查化合物吸收光谱，确认其吸收峰不与氧化后染料（DCF）的激发/发射峰（Ex/Em = 504/529 nm）重叠。

注意事项：

1.     储存液（如以 DMSO 配制）建议分装为单次用量，-20℃ 避光冻存，切勿反复冻融。

2.     为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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本产品仅用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途！

活性氧探针（HPF, APF, DCFH）对各种活性氧物质的反应特异性：

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