活性氧（ROS）检测试剂盒

Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit
 

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产品简介：

活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit，简称ROS Assay Kit）是一种基于荧光染料DCFH-DA（2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯）检测细胞内活性氧水平的常用方法。DCFH-DA本身无荧光，能够自由穿透细胞膜。进入细胞后，它会被细胞内的酯酶水解，生成无荧光的DCFH。由于DCFH无法穿透细胞膜，因此会保留在细胞内。此时，细胞内的活性氧会氧化DCFH，生成具有荧光的DCF。通过检测DCF的荧光强度，可以反映细胞内活性氧的水平。

本试剂盒包含活性氧阳性对照Rosup，便于进行活性氧的检测。Rosup是一种浓度为50mg/ml的混合物。根据检测对象和反应体系的不同，本试剂盒可检测1000个样品。

保存条件: 

-20℃保存（一年有效）

产品组成：

产品使用：

1.     装载探针：

【注意】：对于刺激时间较短（通常2h以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照Rosup和/或待研究药物刺激细胞；对于刺激时间较长（通常6h以上）的细胞，先用活性氧阳性对照Rosup或待研究药物刺激细胞，后装载探针。

1.1        原位装载探针（仅适用于贴壁细胞）：

1)     检测前一天进行细胞铺板，确保活性氧检测当天细胞汇合率达到50~70%。

2)     吸出细胞培养液，加入适量体积以及浓度的待研究药物，于37ºC细胞培养箱内孵育，具体诱导时间根据细胞类型和药物自身特性决定。

【可选】阳性对照Rosup：先用无血清培养液按照1:1000比例稀释阳性对照，通常37℃培养箱内刺激20-30min可以观察到显著的活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异【刺激时间可参考文献或实验经验来调整】。如果刺激后30min内未观察到活性氧水平升高，可以适当提高Rosup的工作浓度；反之，如果活性氧升高过快，则适当降低Rosup的工作浓度。

3)     按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA（10mM），使其终浓度为10μM。吸出细胞培养液，加入适当体积DCFH-DA工作液。【注意】：加入体积以能充分盖住细胞为宜。对于6孔板，每个孔加入DCFH-DA工作液不少于1ml。对于96孔板，每个孔加入DCFH-DA工作液不少于0.1ml。

4)     37ºC细胞培养箱内孵育20min。

5)     用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

1.2 收集细胞后装载探针：

1)     按照常规方法，清洗并收集足量的细胞。【注意】：保证细胞的状态健康。

2)     用适量体积以及浓度的待研究药物重新悬浮细胞，于37ºC细胞培养箱内孵育，具体诱导时间根据细胞类型和药物自身特性决定。【可选】阳性对照Rosup：先用无血清培养液按照1:1000比例稀释阳性对照，通常37℃培养箱内刺激20~30min可以观察到显著的活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异【刺激时间可参考文献或实验经验来调整】。如果刺激后30min内未观察到活性氧水平升高，可以适当提高Rosup的工作浓度；反之，如果活性氧升高过快，则适当降低Rosup的工作浓度。

3)     探针装载前，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA（10mM），使其终浓度为10μM。

4)     离心，吸出细胞内刺激药物，之后用适量DCFH-DA工作液重悬细胞，使得细胞密度为1×10⁶-2×10⁷/ml。【注意】：细胞密度需根据后续检测体系，检测方法，以及检测总量来调整。例如，对于流式分析，单管检测内细胞数目控制在1×10⁴-10⁶之间。

5)     37ºC细胞培养箱内孵育20min。每隔3~5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

6)     用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

2.     检测：

2.1        原位装载法

可用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

2.2        收集细胞后装载法

可用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可用激光共聚焦显微镜直接观察。

3.     参数设置：

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可用FITC的参数设置检测DCF。

4.     其他：

1)     对于某些细胞，若发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000稀释DCFH-DA，使DCFH-DA的工作浓度为2-5μM。探针装载时间也可依情况在15-60min内适当进行调整。

2)     Rosup仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入Rosup阳性对照。

注意事项：

1.     探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2.     探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。

3.     尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4.     为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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本产品仅用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途！

活性氧探针（HPF, APF, DCFH）对各种活性氧物质的反应特异性：

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