Western Blot蛋白免疫印迹(WB)快速实验攻略

蛋白质免疫印迹法，亦被称为Western Blot，是分子生物学、生物化学以及免疫遗传学领域中一项至关重要的实验技术。其核心原理在于，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离的蛋白质样本，能够被转移到诸如硝酸纤维素薄膜（NC膜）或PVDF膜之类的固相载体上。这些固相载体通过非共价键的方式吸附蛋白质，从而确保了电泳所分离出的多肽类型及其生物学活性得以完好保留。随后，以这些固相载体上的蛋白质或多肽为抗原，与特定的抗体发生免疫反应，再进一步与酶或同位素标记的第二抗体结合。最终，通过底物显色或放射自显影的方法，实现对电泳分离出的特异性目的基因表达蛋白成分的检测。

整体流程：样品制备 → SDS-PAGE电泳 → 转膜 → 封闭 → 抗体孵育 → 显色检测。

1、样品制备

蛋白提取（以RIPA裂解液为例）

1）溶解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF（Cat# NBS0101），使PMSF的最终浓度为1 mM。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS（Cat# NBS3021）、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。细胞充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必须分装成0.5-1×10⁶个细胞/管，然后再裂解。

组织样本：按照每20mg组织加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

【注】：RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，或者在裂解液中加入全能核酸酶（Cat#NBS5216）打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

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2、蛋白定量

1）配制BSA标准品体系

标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释，配置成梯度浓度的标准品。或者您可以选购BCA蛋白定量试剂盒（增强型）（Cat# NBS3023）直接使用。

2）取25μL标准品或待测样品加入到微孔板中。

3）每孔加入200μL BCA工作液，振荡30s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30min。

4）冷却到室温，在酶标仪上的540-595nm波长范围处检测吸光度，其中562nm波长为最佳。

5）根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度ug/mL；Y-最终的OD 562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

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3、SDS-PAGE电泳：

电泳凝胶可选择SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、PAGE凝胶快速制备试剂盒、预制胶（Bis-Tris体系）三种。

以预制胶操作为例：

1）剪开包装取出预制胶，撕去胶板底端深绿色胶带，缓慢地拔出梳子，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满电泳缓冲液，外槽液体加入量要高于电泳槽高度1/3。可用移液枪或其他工具吸取电泳缓冲液轻轻吹打加样孔，去除加样孔内残留的储存缓冲液和杂质。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5×SDS-PAGE上样缓冲液（Cat# NBS1047）。水浴溶解后立即室温存放。

3）按照每4 μL蛋白样品加入1μL 5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热 3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）在每个样品孔中上样10-30μg蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，推荐150V，跑50-70min，通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳结束，取出凝胶，使用起胶器或其他合适的工具插入到胶板两侧之间的空隙中，慢慢的上下撬动上、中、下三个不同的位置，然后在另一侧重复操作，直至胶板两侧完全打开。

7）胶板打开后，凝胶可能粘在胶板的任意一侧，将有凝胶一侧的胶板倾斜至水中，轻轻拨动凝胶，使凝胶自由掉落到装有水的器皿中，晃动清洗凝胶，然后取出进行后续转膜实验。

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4、转膜与封闭：

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5 min。（如果检测小分子蛋白质，可省略该步骤，因小分子蛋白容易扩散）。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10 min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2 min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。（膜的选择：0.45μm孔径，用于一般蛋白；0.22 μm孔径，用于分子量小于20 kD蛋白）

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用滚轮或试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入快速转印转膜液(20X)（Cat# NBS5250）中350mA，40min完成转膜。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。注：如果没有出现染色条带，则表示转膜失败，可能需要重新转膜或重新上样电泳。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5 min。

8）脱色：将膜放到0.1M NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用TBST（Cat# NBS7510）清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于10~20mL Western无蛋白快速封闭液（Cat# NBS5252）中，在室温振荡孵育30min完成封闭。 

11）用5mL TBST（Cat# NBS7510）洗涤三次，每次15min。

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5、抗体孵育

1）将膜和一抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4ºC下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST（Cat# NBS7510）洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST（Cat# NBS7510）洗涤三次，每次15min。

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6、蛋白检测：

1）最后一次洗膜的同时，按照ECL试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

2）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液，勿使膜完全干燥。将膜完全浸入发光工作液（125μL发光工作液/cm²膜）中，与发光工作液充分接触。室温孵育3 min，准备立即压片曝光。

3）用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。

4）在X光胶片暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将印迹膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹印迹膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖印迹膜的保鲜膜固定在暗盒内，蛋白带面向上。

5）暗房内压X光胶片，分别曝光不同的时间，如数秒到数分钟。显影冲洗。（从刚开始的10s曝光时间中可以看出适当的曝光时间。由于检测反应的动力学特征，在孵育后信号立即变得最强，但在随后的2小时内会减弱）

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