亚铁离子荧光探针

FerroOrange (Fe2+indicator)   

产品简介：

FerroOrange是一种特异性检测不稳定的铁(II)离子（Fe²⁺）的荧光探针，定位在内质网（ER）。一旦与Fe²⁺反应后，不可逆的生成一种橙色荧光产物（Absmax=542nm，FLmax

=572nm，图1. FerroOrange的光谱特征）。铁（III）离子（Fe³⁺）或其它除铁离子以外的二价金属离子都不会使其荧光增强（见图2. FerroOrange的反应特异性）。FerroOrange也不会与铁蛋白和其它物质中的螯合铁反应。FerroOrange具强细胞膜渗透性和低细胞毒性（见附图3. FerroOrange的细胞毒性测定），非常适用于活细胞成像。

图1. FerroOrange的光谱特征。FerroOrange在0.05M HEPES buffer, pH 7.4内的吸收光谱（左）和荧光光谱。最大吸收波长在542nm，最大荧光光谱在572nm。一旦与Fe²⁺反应，荧光强度显著增加。

图2. FerroOrange的反应特异性。FerroOrange与各种金属离子（左），活性氧或还原剂（右）的反应性。仅当与Fe²⁺反应，FerroOrange呈强荧光。

保存条件: 

-20℃避光干燥保存，至少1年有效。

产品使用：

1. 需要自行准备的材料

1.1 细胞培养级DMSO

1.2 合适的清洗和观察缓冲液（比如：PBS, pH 7.4；HBSS；无血清培养基等）。不要含酚红。

2. 探针准备

2.1 从冰箱取出FerroOrange，置于室温至少30min，将其置于微量离心机内低速离心。将瓶内的粉末离心到管底后，再开盖。

2.2 往一管FerroOrange（24μg）内加入35μl高质量DMSO，用枪反复吹吸5次或以上，使其完全溶解即得到1mM FerroOrange储存液。若单次不能用完储存液，请根据单次用量分装，置于-20℃避光保存，一个月内使用。

2.3 于正式实验前，用中性缓冲液或细胞培养基来稀释1mM FerroOrange储存液到所需工作浓度（比如：1μM），工作液需现配现用，尽快用完。【注意：酸性溶液会氧化FerroOrange，严重影响探针的效率】。

3. 染色步骤

3.1  从玻璃底培养皿上培养的细胞中吸掉培养液。
3.2  吸掉上清液，用 HBSS 清洗细胞 2 次。
3.3  加入含 1μM  FerroOrange 的染色工作液，于 37℃，5% CO₂ 培养箱中孵育 60min。
3.4  在荧光显微镜下观察细胞。

4. 荧光检测

对于荧光显微镜：通用的G激发滤片比如Cy3检测用的滤片。

对于激光显微镜和流式细胞仪：532nm，514nm或561nm激光器用于激发。实在没有，亦可用488nm激光器。发射波长为572nm。

附录 FerroOrange的细胞毒性：

图3. 各种浓度FerroOrange对HepG2细胞的代谢活性。不同浓度的FerroOrange（以1% DMSO作为共溶剂）加入细胞内，培养24h后，用MTT法测定代谢活性。（n=3）

附录FerroOrange的胞内定位：

图4. FerroOrange的胞内定位。将FerroOrange（红色）, ER Tracker（绿色）和Hoechist 3342（蓝色）加载进入HT-1080细胞并成像观察。FerroOrange主要定位在内质网。Bar：10 μm。

注意事项：

1.      FerroOrange主要定位在内质网（见附图4），但也可能检测细胞质池内的Fe²⁺，目前针对这一点未做明确评估。

2.      荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

3.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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