Multiplex Probe qPCR Mix Plus U (Low ROX+)

产品简介：

Multiplex Probe qPCR Mix Plus U (Low ROX+)是用于探针法实时定量PCR的2×浓缩预混液，使用时只需加入模板、引物和探针即可进行反应。本品含有抗体技术修饰的热启动酶Hotstart Taq DNA聚合酶，配合东盛特制的Real Time PCR Buffer，不仅有效抑制引物二聚体和其他非特异性扩增，而且能够提高扩增效率。该试剂引入了 dUTP/UDG 防污染系统，可以在PCR反应前清除含dUTP的PCR产物，有效避免因扩增产物的交叉污染对定量的影响。本品方便用于搭配TaqMan、引物实现全预混Master Mix分子诊断试剂盒，与常见定量PCR仪完美兼容，如ABI、Roche、Bio-Rad等。本品已预混了低浓度ROX参比染料，适用于ABI、Roche等需要低浓度ROX校正的荧光定量PCR仪，可搭配TaqMan等各类荧光探针使用。本产品可以免冰盒配制反应体系，可以直接于常温进行PCR Mix、引物、模板等组分的配制，配制好的PCR反应体系可以常温放置24小时而保持扩增效率不变。

保存条件: 

-20℃保存2年，4℃可短期保存。

产品组成：

[1] 包含 Hotstart Taq DNA 聚合酶，dNTP/dUTP Mix，UDG（Uracil-DNA Glycosylase，尿嘧啶 DNA 糖基化 酶）及反应缓冲液等。

产品使用：

1. 配制反应体系，请于冰上配制以下反应体系：

[1] 引物终浓度建议范围：0.1-1.0μM,通常引物终浓度为0.2μM效果较好。

[2] 使用探针的浓度与Real Time PCR 扩增仪、探针种类和荧光标记物种类有关，使用时请参照相关说明。通常探针终浓度在0 .1-0.5μM 之间。

[3] DNA模板建议用量（25μl体系）：1-10ng cDNA，或10-100ng gDNA。加样体积不宜过小，以免造成较大的误差，但未稀释的cDNA 不宜超过总体积的1/10。

[4] 建议总体积不小于10μl，以免造成较大的加样误差。具体体积范围参考仪器说明。

注意：对于某些固定型号的仪器，需要添加ROX参比染料才能精确测定Ct 值。由于ROX的使用体积较小，建议将ROX提前与qPCR Mix混匀使用。ROX用量参照具体仪器说明，下表仅供参考。

2. 设定反应程序进行qPCR反应

两步法程序示例如下：

[1] 仪器在此阶段进行信号采集。请根据仪器类型设置反应时间。若反应效果不佳，建议采用三步法扩增程序。

经典三步法程序示例如下：

[1] 仪器在此阶段进行信号采集。常用退火温度在55-65℃之间。退火温度一般设定为所用引物的Tm-5℃，若低于55℃，则以Tm值为退火温度，一般不低于55℃。请根据仪器类型设置反应时间。

3. 分析结果

观察扩增曲线；调整基线，计算Ct值；进行相对或绝对定量。

注意事项：

1.      使用前Mix需要完全解冻，充分混匀。尽量避免多次反复冻融。短期使用可保存于4℃。

2.      将（n+x）份反应液混匀后再分注到n个单管中，可降低加样误差。（n为重复次数，x为损耗量，一般为n的1/10）

3.      ABI 的定量仪器大部分需要ROX校正管间差异，Bio-Rad的定量仪器不需要ROX校正。具体仪器请参照其使用说明。

4.      轻轻混匀反应液，避免产生气泡，气泡会干扰荧光检测。可瞬时离心去除气泡。

5.      引物的特异性、用量以及退火温度是影响实验结果的重要因素。务必设计特异性好的引物，随实验结果适当调整引物用量（0.1μM-1.0μM）——特异性较差时减少引物用量，或以3℃为增量提高退火温度，扩增效率较低时增加引物用量。

6.      DNA模板的量应小于500ng/反应，过高的模板量会引起非特异性扩增。应根据模板类型与基因表达量适当调整用量。

7.      各类探针应参照相应的指南进行设计，并根据所用扩增仪类型、探针种类和荧光标记物种类等调整用量。

8.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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