I-SceI

产品简介：

  I-SceI是一种来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的II型内含子编码的核酸内切酶（Intron-encoded endonuclease），特异性识别并切割18 bp非回文序列（5'-TAGGGATAACAGGGTAAT-3'），形成4 bp的3'突出黏性末端。由于识别序列极长，其在基因组中自然出现的概率极低（约每7×10^10个随机碱基出现一次），这使得I-SceI成为精准基因组操作的理想工具。

识别位点：

TAGGGATAACAGGGTAAT
5'...T A G G G A T A A ↓ C A G G G T A A T...3'
3'...A T C C C ↑ T A T T G T C C C A T T A...5'

产品组成：

保存条件: 

-20℃保存，2年有效。

建议反应条件：

1× FastCut缓冲液；

37℃温育；

参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。

失活条件：

80℃温育20 min。

活性定义:

1 活性单位（U）是指在37℃条件下反应1 h酶切1 μg pUC-I SceI 所需的酶量。

功能活性检测：

37℃下，在20 μl通用FastCut反应体系中，1 μl I-SceI能够 在15 min内完全消化1 μg pUC-I-SceI。

超长时间温育检测：

37℃下，在20 μl通用FastCut反应体系中，将1 μl I-SceI与 1 μg pUC-I-SceI 共同温育3 h，未检测到其他核酸酶污染引起的底 物非特异性降解。

酶切-连接-再酶切检测：

37℃下，使用10倍酶量的I-SceI消化DNA底物，回收酶切产物， 在22℃下使用T4 DNA Ligase (Fast)可以将超过95%的酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开约95%以上的连接产物。

使用方法：

1. DNA酶切流程

① 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：

① 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：

a.本体系适用于经过纯化的PCR产物酶切。未纯化的PCR产物具备一定的离子强度，10× FastCut Buffer 加入量可适当减少至2 μl。但由于DNA聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对PCR产物进行纯化。

② 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；

③ 37℃温育15 min（质粒），或15~30 min（PCR产物），或30~60 min（基因组DNA）； ④ 80℃温育20 min即可使酶失活，停止反应（可选）；

⑤ 如果使用FastCut Color Buffer进行酶切反应，得到的产物可以直接进行上样电泳。

2. 适用于质粒的扩大反应体系

注：如果总反应体系大于20 μl，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。

不同DNA中的酶切位点数量

甲基化修饰影响

注意事项：

1.      归位内切酶不具有限制性内切酶那样严格定义的识别序列。因此，单个碱基的改变并不影响其识别功能，但是会不同程度地降低酶切效率。识别序列中必需碱基的准确区域还不确定。列出的识别序列是已知可识别并酶切的位点。

2.      随酶提供对照质粒DNA，浓度为100 ng/μl。I-SceI酶切产生 2711 bp 的片段。pUC-I-SceI为氨苄抗性，可自行转化后大量提取用于其他实验。

3.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。