EcoRI, ADCF

产品简介：

EcoRI, ADCF 经过基因工程重组，能够在 15 min~1 h 内精确完成质粒 DNA、PCR 产物或基因组 DNA 等的酶切。

本品的发酵重组表达、纯化、制剂等各个环节，都不使用包含动物来源的成分，也未使用抗生素。

识别位点：

GAATTC
5'...G ↓ A A T T C...3'
3'...C T T A A ↑ G...5'

同裂酶：FunII

注：同裂酶对于不同的甲基化修饰也许具有不同敏感性。

注：ADCF(animal derived component free), 不含动物源性相关组分。

产品组成：

保存条件: 

-20℃保存，2年有效。

特性和用法:

• 生产全程无动物源性成分

• 质量标准更高，严格控制宿主残留

• 满足疫苗生产要求

失活条件：

80℃温育20 min。

甲基化敏感性：

对于被 CpG 甲基化的DNA，剪切可能受阻，
对于被 EcoBI 甲基化的 DNA，剪切可能受阻。

活性定义:

1 活性单位 (U) 是指在 50 μl 反应体系中，37℃ 1 h内完全酶切 1 μg λDNA 所需的酶量。

蛋白纯度检测:

本品经SDS-PAGE检测纯度 ≥95%。

核酸内切酶残留检测：

将20 U酶液与超螺旋质粒DNA 在37℃ 温育4 h，通过 DNA 电泳检测质粒无变化。

蓝白斑检测：

将含有单一lacZα基因的载体以1 μl EcoRI, ADCF消化，重新连接后转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有对应抗生素、IPTG和 X-gal 的 LB培养基平板上。连接正确的产物会生长出蓝色菌落，而连接错误（即DNA末端切口不完整）的产物将得到白色菌落。对于 ADCF系列限制酶而言，白色菌落比例应小于1%。

DNase 残留检测：

将20 U酶液与双链 DNA 底物在37℃ 温育16 h，通过 DNA电 泳检测双链DNA底物无变化。

RNase 残留检测：

将20 U酶液与RNA在37℃ 温育1 h，通过电泳检测RNA无降解。

酶切 - 连接 - 再酶切检测：

最适反应温度下，将20 U酶液消化底物，回收酶切产物，在 22℃下使用适量 T4 DNA Ligase (Fast) 可以将酶切产物重新连接, 将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开连接产物。

宿主DNA残留检测：

将酶液中残留的核酸经E.coli 16S rDNA特异性的TaqMan qPCR检测，E.coli 基因组残留低于 10 pg。

宿主蛋白残留检测：

本品经ELISA法检测E.coli宿主蛋白含量≤ 50 ppm。

微生物限度检测：

本品经微生物计数法检测，需氧菌总数≤5 cfu/ml，霉菌和酵母菌 总数≤5 cfu/ml。

细菌内毒素残留检测：

本品细菌内毒素残留＜0.5EU/KU

使用方法：

① 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：

a. DNA 底物中应不含苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、洗涤剂或高浓度盐，否则将会影响EcoRI, ADCF 酶活性；甲基化的 DNA 会抑制某些限制性内切酶酶切反应。

② 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；

③ 37℃温育15 min~1 h，一般推荐5 U~10 U酶/μg DNA、10 U~20 U酶/μg基因组DNA，温浴1 h，如需过夜酶切反应，请将酶量调整至 1U；

④ 80℃温育20 min即可使酶失活，停止反应，或者通过吸附柱或苯酚/氯仿纯化终止反应； ⑤ 反应体系中加入的酶体积不应超过总体积的10%，避免酶中过多的甘油引起星号活性;

⑥ 限制性内切酶存储缓冲液中的添加剂(例如甘油、盐)与底物溶液中的污染物(例如盐、EDTA 或乙醇等)相同，反应体积越小，酶切反应抑制效应越强；

⑦ 小体系推荐加样体系：

b. 为避免蒸发，10 μl反应体系的孵育时间不应超过1 h。

不同DNA中的酶切位点数量

甲基化修饰影响

注意事项：

1.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。