一氧化氮（NO）检测试剂盒（显色法）

Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit

产品简介：

一氧化氮（Nitric Oxide, NO）是一种活性基，在许多关键生理功能中发挥重要作用。一氧化氮，一氧化氮合酶（NOS）催化精氨酸的氧化产物，参与宿主防御和发育、调节蛋白活化、以及与功能生物分子之间的直接共价相互作用。一氧化氮生成后迅速代谢生成亚硝酸盐（Nitrite）和硝酸盐（Nitrate），两种首要的、稳定的和非挥发性的裂解产物，通过对这两种产物的测定能间接反映样本内的一氧化氮水平。

本一氧化氮检测试剂盒（Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit）利用经典的Griess reagent，对亚硝酸盐进行定量测定。本试剂盒以亚硝酸钠为标准品，通过优化的检测体系，检测下限达1μM，且在1~100μM范围内具有优秀的线性关系。本试剂盒不仅能检测细胞、组织或培养液中的一氧化氮含量，还能检测血清、血浆或尿液中的一氧化氮含量。

保存条件: 

2-8℃避光保存，至少4个月稳定。

产品组成：

产品使用：

【注意】本试剂盒可用于培养液中的一氧化氮测定，培养液内的酚红和10%血清对测定无明显干扰。

【注意】本试剂盒可用于血清中的一氧化氮测定。当只需粗略计算，可直接用水稀释标准品，从而计算出血样中一氧化氮含量。当需精确计算，如果待测的正常血清是常见血清，能从文献查阅到一氧化氮浓度，那么用此已经一氧化氮浓度的正常血清稀释标准品，这样能得到比较精确的一氧化氮浓度。或使用已知浓度的人或其他动物血清来稀释标准品也可达到目的。或参考文献进行血清中一氧化氮浓度的测定。

【注意】样品中存在的一些内在成分可能会干扰测定，导致OD值和灵敏度降低。干扰程度依次顺序：尿液>血清>血浆>培养基。

一、需要设备

96孔酶标仪或可见光分光光度计，最佳波长540nm，或在520~560nm下测定，灵敏度可能会降低。

二、准备步骤

2.1实验前将试剂从冰箱取出回温至室温。

2.2 标准品准备：每次测量均新做标准曲线，用待测样品所用溶液来稀释标准品，使得浓度在1~100μM内。

比如：当样品为细胞培养液上清，细胞培养液为DMEM+10% FBS，则用DMEM+10% FBS稀释标准品。标准品的浓度通常可取0，1，2，5，10，20，40，60，80，100μM。

2.3 样品准备：a）当样品为培养液上清，可直接取样。如果存在沉淀物，则需离心后取上清；b）当样品为组织或细胞，可快速冻融裂解，然后离心沉淀取上清，体积不足50μl，可用双蒸水、超纯水或0.9% NaCl稀释（相应的标准品也需用双蒸水、超纯水或0.9% NaCl稀释）。细胞或组织也可用免疫印迹及免疫沉淀用裂解液（不含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）来裂解，同样的，标准品需用裂解液稀释。

三、测定步骤

3.1取50μl标准品或样品，加入96孔板内，做好标记；

3.2每孔加入提前回至室温的50μl Griess reagent I；

3.3 每孔加入提前回至室温的50μl Griess reagent II；

3.4 室温避光孵育5min；

3.5 在540nm（或520~560nm）测定吸光度。需在30min内测完，以防褪色降低灵敏度。

3.6 以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标绘制标准曲线，获得横纵坐标之间的函数关系式。之后将样品OD值代入公式来计算一氧化氮浓度。

注意事项：

1.      本试剂盒内的组分若保存不当发生颜色变化或沉淀，说明溶液已经失效，请勿再用。

2.      当检测细胞或组织一氧化氮含量，不建议使用RIPA裂解液，因其可能在后续实验中产生沉淀，影响测试。建议使用免疫印迹及免疫沉淀用裂解液（不含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）。

3.      本试剂盒仅测定的是亚硝酸盐含量，不能检测硝酸盐，反映的并非总一氧化氮含量，只能在很大程度上反映一氧化氮的相对量，适合不需要精确定量的实验。若需要测定总一氧化氮含量，请选择总一氧化氮检测试剂盒（显色法）（货号：NBS5940），此试剂盒利用硝酸盐还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，然后利用Griess reagent测定亚硝酸盐，进而反映总一氧化氮水平。

4.      本试剂盒对人体有害，请注意适当防护，避免直接接触人体或吸入体内。

5.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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