Propidium Monoazide (PMA) 叠氮溴化丙锭

产品简介：

叠氮溴化丙锭（Propidium Monoazide，PMA）是一种光反应的DNA结合染料，用于微生物（比如：细菌、病毒和真菌）的活力PCR（v-PCR）分析。作为一种DNA修饰剂和光反应染料，PMA高亲和结合DNA。经可见光刺激发生光裂解后，PMA共价吸附到DNA上，这一改性的DNA不能被PCR扩增。PMA染料不具细胞膜渗透性，因此，在含活死细胞的群体内，只有死细胞对DNA修饰剂敏感，由于具受损的细胞膜。PMA染料的这一特性，使其高度适合通过qPCR的手段来选择性检测活细菌（见Fig 1. PMA的作用机理）。

Fig 1. PMA的作用机理示意图。细胞膜非渗透性染料-PMA选择性和共价修饰死细菌（具受损细胞膜）来源的DNA，而活细菌来源的DNA保持不变。由于PMA修饰的DNA不能扩增（这一产物抑制PCR聚合酶的扩增反应），因此，后续的qPCR能选择性定量活细菌。

叠氮溴化丙锭（Propidium Monoazide，PMA）具有以下特征：①利用qPCR技术选择性检测活细胞；②死细胞特异性染料，结合到DNA上；③光活化后共价交联到DNA上；④适用于多种样本类型包括：细菌、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核细胞；能应用在食品和水安全和环境测试，能与qPCR、NGS、Sanger测序和LAMP技术结合使用。

产品特性：

1） 分子量：511 g/mol
2） 外观：深红色固体
3） Abs：464nm（光裂解前）
4） Abs/Em：510/610nm（光激活后交联到核酸上）
5） 溶解性：溶于DMSO、DMF、H₂O（20mM）

保存条件: 

-20℃避光干燥保存，至少1年有效。

产品使用：

1. 活力PCR（v-PCR）实验前考虑事项

1.1 活力PCR基于细胞膜渗透性来区分活细胞和无活力细胞。许多杀死细胞的方法都会引起受损细胞膜，从而适用于活力PCR分析。但是，某些方法比如紫外曝光，不会立即引起破损的细胞膜。文献搜索和预实验有助于确定活力PCR适用于您使用的细胞类型和处死方法。

1.2 引物选择是重要考虑因素。如果希望同时检测混合物中的所有细菌类型，靶向rRNA的引物（宽谱物种特异性）是很好的选择。如果只想检测某一种特定的细菌类型，则需设计或查找特定的引物。染料分子是随机结合DNA双链。因此，扩增子越长，染料结合到扩增子上的可能性越高。建议扩增子的长度至少100bp，扩增子越长通常得到更好的结果。

1.3 进行活力PCR实验前冰冻样本，可能损伤细胞膜，并且给出错误的阴性结果。我们发现冰冻对革兰氏阳性菌的结果影响高于革兰氏阴性菌。光照后样本可进行冰冻保存。

1.4 为了让PMA共价结合到死细胞DNA上，活力PCR需先进行光活化步骤。可以用蓝色或白色光源来刺激。总的来说，光照越强，光活化步骤越有效。非LED光，比如：卤素灯，可能会加热样品对测定产生负面影响。

1.5 PMA的作用方式有一部分是通过沉淀从样本中去除PMA-结合的DNA，因此，不同样品间每一个qPCR反应中模板DNA的量不需要归一化。取而代之的是，使用每个样本中洗出的等体积gDNA用于PCR反应。作为qPCR反应的阳性对照，1ng 纯化的gDNA足够产生良好的信号。

1.6 为了确保待测样本的PMA有效性，最好建立活细胞和死细胞对照，每个分别设置加和不加PMA组。每一组对照因PMA引起的Ct值变化（dCt）都需测定。

2. 储存液制备

将低温保存的PMA粉末置于室温回温至少20min，低速离心使粉末沉至管底。避光条件下加入98μl无菌水，充分溶解混匀，即得到20mM储存液。储存液根据单次用量分装，-20℃避光冻存，至少6个月有效。

3. 活力PCR操作方法

以下是用PMA检测细菌培养物的通用操作方法。建议首先对测试物种的活菌和死菌对照进行对照实验。对于复杂样本，比如粪便或土壤，可能需优化样本稀释、染料浓度和光处理时间。对于稀释样本，比如水样，可能在PMA处理前需对样本做过滤或浓缩处理。

3.1 用合适的培养基接种和扩增细菌（扩增体积依实验用量设置）。过夜或更长时间振荡培养，直至培养悬液OD₆₀₀接近1。

3.2 （推荐）：为了制备死菌对照样本，于90℃处理5min使得细菌热失活。如果想比较活力PCR与平板培养菌活，可以在适宜的培养基平板上涂布10μl热失活的细菌，以及涂布10μl（1：100倍未处理的细菌）于另一平板上。适当条件下培养观察菌落生长情况。

3.3 取400μl细菌培养物到一干净的离心管。每一个样本，需设置一管PMA处理菌，和一管非PMA处理菌（不加染料），为了计算dCt值。

3.4 室温避光下取适量的PMA储存液到管内使其终浓度为50μM（比如：1μl 20mM储存液加入400μl菌液）

3.5 室温避光孵育10min，孵育期间可以适当指拨混匀，也可用铝箔纸包好置于摇床上孵育。

3.6 将样品曝光， 可以使用蓝色或白色光源， 不同的光源照射时间需自行摸索，使PMA与DNA充分交联。例如：可用60W的蓝光灯，照射15min。通常，光线越亮，效率越高。非LED光，比如：卤素灯，可能会加热样品对测定产生负面影响。

3.7 5000g，离心10min。

3.8 使用标准方法或商业化的试剂盒抽提基因组DNA，用于后续的qPCR实验。

3.9 选择特异性的引物来执行qPCR（关于引物选择，每一个PCR反应确保使用相同体积的洗脱DNA）。经PMA修饰的DNA会在qPCR反应中表现出扩增延迟效应。

注意事项：

1.      荧光探针均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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