Magneti-G Anti-RFP Beads

产品介绍

1 RFP标签

红色荧光蛋白基因是从海葵中分离出的一种红色荧光蛋白基因，其蛋白质的最大吸收光谱为 583 nm，不需要任何预处理便可检测到，通过重组 DNA技术将 RFP标签融合到目的蛋白的 C端或 N端后，可以检测其融合表达蛋白的表达、定位纯化，该系统已广泛应用于各种细胞类型，包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等。

2 Anti-RFP抗体

Anti-RFP抗体可以用于检测和RFP标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，也可以用于RFP融合表达蛋白的纯化、定性或定量检测。本公司的Anti-RFP亲和力较高，适合做 WB、IP等蛋白互作实验。

3磁珠性质

高聚物磁珠采用高分子聚合技术将超顺磁性材料和高分子材料完美地结合在一起，具有更快的磁响应性同时保持微球良好的分散性、极低的非特异性 吸附和更丰富的结合位点。磁珠具体性能见表 1。

表 1：Magneti-G Anti-RFP Beads产品性能

使用方法

本操作流程主要为蛋白互作实验，每次反应使用 20 μl Magneti-G Anti-RFP Beads。

1 推荐缓冲液（自备）

表 2 ：缓冲液配置

2 磁珠漂洗

1) 将磁珠充分混匀后取 20ul磁珠置于离心管中，向管中加入 500ul洗杂缓冲液，上下颠倒混匀 5-10次。

2) 将离心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。

3) 向管中加入 500ul洗杂缓冲液，上下颠倒混匀 5-10次，将离心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。

4) 重复操作 3次。

3 样品孵育

1）向上述漂洗好的磁珠中加入 500-1000ul的细胞裂解样品，常温或 4℃下孵育 60min（建议在旋转混匀仪上孵育，使样品和磁珠充分接触）。

2）孵育结束后，将离心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，将上清转移至新的离心管中，留样备检。

3）向离心管中加入 500ul洗杂缓冲液，轻轻颠倒混匀 5-10次后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后弃去上清。

4）重复操作 5次。

注：孵育温度和时间范围推荐为：室温 0.5 h-2 h或者4℃、1 h-4 h，根据实际的结合效果适当调整孵育时间，一般情况下不建议过夜孵育，过夜孵育 可能会引起过多的非特异性吸附。磁珠每次洗涤，加入洗杂缓冲液后可以冰上静置 3-5分钟。

4 蛋白洗脱

1) 洗脱液洗脱

每 20ul原始磁珠体积加入 40ul洗脱液，常温或 4℃洗脱 5-10min，期间轻轻混匀 3-5次。孵育结束后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后， 吸取上清至新的离心管中，加入少量的中和缓冲液将 pH调至中性，最后进行 Western检测。

2) SDS-PAGE上样缓冲液洗脱

每 20ul原始磁珠体积加入 60ul的 1×SDS Loading Buffer，轻摇摇晃混匀后 95-100℃高温处理 5-10min。将离心管置于磁力架上分离 10s，取上清 进行 SDS-PAGE电泳或进行 Western检测。

注意事项

1) 本产品保存在 2-8℃，不可冻结保存；

2) 本产品出现轻微团聚属正常现象，可正常使用；

3) 本产品不要使用含有 DTT等还原剂的细胞裂解液样品，DTT可能会导致抗体配体的脱落；

4) 本产品能耐受≤2M尿素，高浓度的尿素会导致抗体配体脱落；

5) 在清洗和洗脱时避免吸取到磁珠，清洗时吸取到磁珠会影响最终的载量，洗脱时吸取到磁珠会影响目的蛋白的质量和电泳效果，第一次洗脱后可 以将洗脱液置于新的离心管中，再次置于磁力架上进行吸附。

参考信息

1）RFP tag IP实验：样品为胞内表达蛋白，含有 His和RFP标签。

2）取 0.5ml悬浮细胞（≈1.5×10⁶个）常温下 1×PBS（pH=7.4）清洗三次后快速进行裂解、离心；

3）加入 20 μl已经清洗过的磁珠于离心后的上清中摇晃孵育 30min；

4）将含有磁珠的样品管转移到磁力架上，分离磁珠和液体，用移液器吸走上清，留下磁珠；

5）用洗杂缓冲液清洗 5次后加入 2×SDS Loading Buffer 99℃高温处理10min后进行 WB；

6）检测抗体为 Anti His-HRP mAb，阴性对照(-)为不带有 RFP抗体的磁珠和样本孵育。

常见问题与解答

1) 聚合物磁珠和琼脂糖磁珠有何区别？

a) 琼脂糖磁珠是带孔微球，粒径在 30-100 μm，交联时会有一部分配体会进入球孔内部，所以偶联载量相对较高，适用于蛋白的快速纯化；而聚合 物磁珠通常粒径为 1-3 μm以下，配体主要分布在微球表面，这种类型的磁珠能够快速结合蛋白，空间位阻影响小，适用于蛋白互作实验，但其载量不高；

b) 推荐使用琼脂糖磁珠进行蛋白纯化实验，使用聚合物磁珠进行蛋白互作实验如 IP、Co-IP和 pull down实验等。

2) 为何结合不到目的蛋白？

a) 可能是由于蛋白无表达造成的，建议在纯化前用WB检测下蛋白原始表达量，如果WB无信号，目的蛋白很难捕获；

b) 样本中有高浓度的还原剂等干扰物质，建议选用合适的裂解液，或者直接超声破碎（CO-IP实验不建议使用超声破碎）。