外泌体快速纯化试剂盒（柱式法）

产品介绍 

1 外泌体功能介绍 

外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）属于细胞膜囊泡，包含蛋白，mRNA，microRNA，DNA和脂类。外泌体直径30-150nm，多种细胞在正常及病 理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，且外 泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体具有多种多样的功能，其功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与 到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等。 

2 外泌体的形成过程 

膜双层通过磷脂的不对称分布来维持脂质的“多面性”。外膜富含磷脂酰胆碱和鞘磷脂，而内膜主要由磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS) 和磷脂酰乙醇胺形成。微泡由质膜出芽形成，主要原因是由于Ca2+通过磷脂双分子层破坏了膜的不对称性，导致磷脂跨膜双层的重新分配， 促进膜起泡，最终导致出芽过程的进行，出芽形成芽泡，将泡体中的外泌体释放到细胞外，这样就形成了一个完整的外泌体。 

3 试剂盒介绍 

试剂盒采用分子排阻色谱原理， 根据被分离样本中组分的分子尺寸大小实现外泌体的分离。本试剂盒具有快速、高效、操作简单、对设备要求 低等特点，可在60min内完成外泌体的分离纯化。提取的外泌体产物质量稳定可靠、蛋白污染程度低，可以温和有效的获得完整的外泌体，可 用于蛋白提取分析、RNA提取分析、细胞功能检测等下游生物学实验。 

4 层析柱性质 

纯化柱装有8.5ml Smartarose CL-4B,Smartarose是一种球形琼脂糖凝胶过滤基质，Smartarose CL-4B琼脂糖含量4%的Smartarose 4B的衍生物，化学和物理性能更优异，流速更快。

5 样本选择 

柱式法外泌体纯化原理是尺寸排阻，根据分子量大小实现先后分离，过柱后样品会被稀释，我们建议客户使用外泌体浓度较高的样品进行过 柱，保证收率。

使用方法 

1 样品预处理 取待纯化的样品进行差速离心，首先用300g 离心10min，继续收集上清，再用2000g 离心10min，最后用10000g 再离心10min，将收集的上 清用0.22µm的滤膜进行过滤处理（可选），如果样本体积较大可以配套使用本公司外泌体快速纯化试剂盒（BK0047）进行浓缩，浓缩方法参考外 泌体快速纯化试剂盒说明书或自购超滤管（100 kD）进行浓缩。 

2 样品纯化

1) 脱盐柱准备 将纯化柱垂直置于重力柱支架上，或用铁架台固定，先后打开上盖、下盖，依靠重力流干保护液。 

2) 平衡 加入4 ml平衡液（自主选择合适溶液）对预装介质进行平衡，重复5次，最终使用平衡液体积约3倍介质体积。 

3) 上样 加入样品，样品上样体积0.5ml，上样体积不足时用平衡液补充样品至0.5 ml。 

4) 洗脱 待样品进入填料后，继续加入平衡液进行洗脱，分管收集洗脱液。从加入样品开始计算，先收集前端4管，0.5ml每管，此部分为平衡液，然后再按 照固定体积0.5~1.0 ml/管收集样品，检测每管外泌体含量，计算回收率。平衡液至少添加至杂质蛋白洗脱完全再停止(推荐洗脱17ml，约两倍 柱体积)。

3 外泌体保存和应用 将收集的外泌体溶液保存于-20℃或-80℃冰箱中，尽量避免反复冻融，可分装以备下游检测和应用。如需无菌培养，可使用0.22 µm无菌过滤 器进行过滤收集。

注意事项 

1) 外泌体较脆弱，建议尽量在低温下进行操作，防止外泌体活性受损，影响下游实验； 

2) 提取的外泌体保存在-20℃或-80℃中，可保存半年时间，外泌体分装使用，尽量避免反复冻融。

参考信息 

293 细胞外泌体纯化： 

1) 取50ml培养基上清进行预处理，差速离心去除杂质颗粒，使用外泌体快速纯化试剂盒（BK0047）进行浓缩50倍（重悬至1ml）； 

2) 纯化柱置于重力柱支架上，先打开上盖，再拔掉下堵头，自然重力流干保护液； 

3) 用20ml 1×PBS缓冲液平衡纯化柱，重力流干； 

4) 上样1.0ml浓缩样品，上样即开始收集，标记第1管；

5) 使用1×PBS缓冲液洗脱纯化柱，0.5ml/管收集35管。 

6) 对收集样品进行分光光度计检测，WB检测，纳米流式检测及电镜检测。 

常见问题与解答 

1 如何快速鉴定纯化后的产物是否含有外泌体？ 

1) 直接裂解洗脱样本，通过吸光值、BCA或者Bradford检测下蛋白浓度，通常外泌体的获取量和蛋白浓度呈现正相关； 

2) 外泌体检测最直接的方式是仍然是WB检测，外泌体的几个特征性标志物CD9、CD63、CD81、TSG101和HSP70等，通常WB选用2-3个 特异性蛋白进行WB检测可初步判断样品中是否含有外泌体。 

2 为何洗脱后的样本中不含有外泌体或含量低于正常值？ 

1) 可能是样本中所产生的外泌体较少，适当扩大预处理的样本容量，并排除培养过程中因活率过低或其它原因导致的外泌体污染； 

2) 虽然看不见但可以结合下游实际需求进一步分析，可组合其它的检测方法如WB、纳米流式等进行辅助验证； 

3) 在实际提取分离过程中是否严格按照说明书要求进行分离纯化，排除是否因操作不当造成样本的流失； 

4) 根据所提取样本的特性而定，提取本试剂盒推荐来源以外的外泌体时，并不能够保证提取效率与从293细胞培养基上清中提取效率相当， 但仍需尽可能保证4℃的条件下进行，排除外泌体降解的可能以及样本来源差异。 

3 如何长时间保存外泌体洗脱液？ 

1) 外泌体会降解不推荐长时间保存，如果不得以需要长期储存，建议在-20℃或-80℃下保存最长不超过30天，若在4℃下储存最长不超过7 天； 

2) 注意分装，避免反复冻融。 

4 外泌体分离方法哪种方式最好？ 

1) 没有最好的方法，主要根据实验需求而定，本款试剂盒的最大特点就是比传统的超速离心法更快，且对设备的依赖性更低； 

2) 有条件的情况下可以尝试多种方式组合提取。

保存与运输 

运输：常温运输。 保存：2-8 ℃冷藏保存。