His Protein Pull Down Kit

产品介绍 

His Protein Pull down Kit是一款能够高效完成标签诱饵蛋白与靶蛋白共沉降的试剂盒。其包含高性能Co Smart Beads 6FF，能够高特异性 的捕获带有6×、9×、12×His标签的诱饵蛋白。另外试剂盒内经过优化的缓冲液，为蛋白互作实验提供了最佳的反应条件，增强了蛋白互作实 验的稳定性，更有效的去除实验背景。Co Smart Beads 6FF是一种新型IMAC填料，螯合有非常牢固的Co离子，拥有更为广泛的适配性，试剂耐受情况见表1。

表1. Co Smart Beads 6FF试剂耐受情况

本产品可广泛应用于大肠杆菌裂解物产品组、细胞裂解物、细胞分泌上清等样品中的蛋白互作验证，具体组分见表2。

‍‍‍表2. His Protein Pull Down Kit产品组分‍‍‍

‍‍注：表格中标注的为填料实际体积（填料：保护液=1:1），如0.15ml填料的混悬液体积为0.3ml。‍‍

‍使用方法 

1 缓冲液的准备 

可使用试剂盒准备的缓冲液，也可根据实际情况配制不同的缓冲液体系。所有缓冲液在使用前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，缓冲液 建议4℃保存，若试剂浑浊，请立即丢弃。‍

下列可能用到的试剂及材料未提供，需额外准备： 

1）电泳上样缓冲液（SDS Loading Buffer），非还原性（5×）：0.3M Tris-HCl，pH 6.8，5% SDS，50% 甘油，0.5% 溴酚蓝； 

2）二硫苏糖醇（DTT）； 

3）蛋白酶抑制剂； 

4）蛋白互作所用诱饵蛋白、靶蛋白。

2 样品准备方案 

方案 I: 大肠杆菌细胞的裂解 

1）按照适当方法进行细菌培养、诱导、离心收菌，先加入Balance/Wash Buffer（添加比例：1g菌体加入9ml），震荡完全分散菌体，加入Lysis Buffer A( 添加比例：1g 菌体加1ml)。混合均匀后室温裂解5-10min，菌体悬液渐渐变清亮透明。 

2）按菌体悬液总体积加入 1/1000 体积的 Lysis Buffer B（如 10ml 已裂解菌液加入 10μl Lysis Buffer B），混合均匀后，消化核酸反应 5-10min，反应后菌液应不粘稠。 

3）按照适当方法离心（例如：12000×g，5-10min），分离上清与沉淀。如果是可溶蛋白，直接取上清进行使用，如果是包涵体，则取沉淀，对包涵 体进行洗涤以及变性复性。 注：如裂解终产物较为浑浊，或样品中目的蛋白丰度较低，可调整Lysis Buffer A的使用量。

方案 II：哺乳动物细胞的裂解 

 1）将细胞悬液以1000×g离心5min，收集细胞，弃上清。 注：如果是贴壁细胞，通过胰蛋白酶消化将其从培养容器表面释放。 

 2）用预冷的Balance/Wash Buffer 将细胞团轻轻重悬，将细胞悬液以1000×g离心5min，收集细胞，弃上清。同时配制裂解液，配方为 Balance/Wash Buffer：Lysis Buffer A=7：3，配制好后置于冰上预冷。 

 3）向细胞团块中加入上述步骤2）的预冷裂解液。每50mg细胞团块使用500μl。 

 4）将上述的样品在冰上孵育30min，期间混匀几次，13000×g离心10min，去除细胞碎片。 

 5）将上清转移到一个新管中，准备蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。 

注：如果互作蛋白与核酸存在相互作用，可加入Lysis Buffer B(1000×)进行样本处理。

3 蛋白互作

A.填料平衡 

1）将 Co Smart Beads 6FF 充分混匀，取50µl加入到装有垫片的Pull-down ColumnAccessory 内管中（填料实际体积占悬液一半，即实际 填料为25µl）。 

2）取下红色堵头，可用掌上离心机或其他微量离心机6000rpm瞬时离心，去除填料保存液。 

3）堵住下堵头，每次取500µl的Balance/Wash Buffer加入到填料中，充分混匀填料与液体后，取下堵头瞬时离心，甩去管内液体并将液体丢 弃，填料重复平衡3-5次后待用。 

注：填料不可长时间干涸，且每次清洗、上样、洗脱均需吹打混匀填料与样品。 

B. 上样诱饵蛋白 堵住下堵头，向上述平衡好的填料（步骤A）中加入诱饵蛋白，如诱饵蛋白为纯样，根据填料载量推荐上样量为250µg，如是裂解产物，可根据跑胶条带或者直接上样。建议上样前用Balance/Wash Buffer稀释补充体积至500µl，离心柱管最大装载体积为800µl，室温混旋孵育 30min 以上。 

注：非离心时，离心柱管应用堵头封闭下出水口。孵育温度和时间范围推荐为：室温、30min-2h，或者4℃、1h-16h，根据实际的结合效果进行调整。 

C. 上样靶蛋白 

1）诱饵蛋白孵育完成后，取下堵头，将孵育完成的填料（步骤B）瞬时离心甩干液体（上清留样，用于后续检测）

2）每次取500µl的Balance/Wash Buffer 加入到孵育完成的填料中，充分混匀填料与液体后，进行瞬时离心，填料重复清洗3-5次后待用。 

3）如洗杂效果不佳，可加入Wash Buffer Enhanced进行增强洗杂，后续步骤清洗时，同样需要使用Wash Buffer Enhanced。如果上一步清洗 满足需求，可跳过此步骤。 

4）堵住下堵头，将带有靶蛋白的裂解液或离心后上清加入到清洗后的填料中，如需进行稀释，可用Balance/Wash Buffer将样本稀释至 500ul，室温孵育1h以上。 

注：孵育温度和时间范围推荐为：室温、1h-2h，或 者 4℃、1h-16h，根据实际的蛋白互作效果进行调整。 

5）孵育完成后离心甩去液体（上清留样，用于后续检测），每次取500µl的Balance/Wash Buffer加入到孵育完成的填料中，充分混匀填料与 液体后，进行瞬时离心，填料重复清洗3-5次，最后一次清洗可以将介质-诱饵蛋白-靶蛋白复合物转移至一个新的Pull-down Column Accessory 外管中进行。

4 洗脱 

方案 I: 竞争\酸\变性洗脱 

1）本试剂盒提供Elution Buffer，其中含有250mM咪唑，吸取150µl-250µl Elution Buffer 加入到清洗好后的填料中，充分混匀填料与洗脱液 后，进行离心，收集洗脱液。若洗脱不充分，则可进行多次洗脱。 

2）使用甘氨酸（pH3.0）同样可以洗脱蛋白，此方案需要自备试剂，甘氨酸（pH 3.0）洗脱可能会损伤蛋白，并且使用后需要用1M Tris，pH 8.5 进行中和。 

3）使用 SDS Loading Buffer 亦可进行洗脱，SDS Loading Buffer 洗脱能力较强，可以洗脱填料上的绝大部分蛋白（包括非特异性吸附），但是 会使蛋白失活，无法维持三维结构。会使蛋白失活，无法维持三维结构。

方案 II：煮球 

用150µl-250µl Balance/Wash Buffer 或 Wash Buffer Enhanced 重悬填料，直接将填料混合物取出添加SDS Loading Buffer，95-100℃煮样10min，12000rpm离心10min后取上清进行跑胶。

注意事项 

1）在进行蛋白互作操作之前，请务必认真阅读此说明书。 

2）除非另有说明，所有操作建议于4℃下进行。 

3）填料应保存在储存溶液中，防止干燥，使用前请充分混匀。 

4）如果需要在还原条件下洗脱，向1×电泳上样缓冲液中加入DTT (终浓度10-20mM)。 

5）经煮沸后的填料失去结合能力，经煮沸的填料不应再次使用。 

6）为保证最佳的实验结果，请选择纯度较高的诱饵蛋白进行蛋白互作。 

7）对于蛋白互作实验，不同类的诱饵蛋白与靶蛋白结合的亲和性是有区别的，因此若本试剂盒提供的缓冲体系不能获得很好的实验结果，可 自行优化缓冲液进行实验。 

8）实验设计时，建议加入对照组，以备后续实验结果分析。 

9）在确定实验结果前，建议保留各步骤的样品以备验证（如input、流穿、洗杂、洗脱、煮球）