无缝克隆试剂盒

DNA Assembly Cloning Kit 

产品介绍 

DNA Assembly Cloning Kit 是一种简单、快速并且高效的DNA无缝克隆试剂盒，可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。使用任意方式 将载体进行线性化，在插入片段正/反向PCR引物5’端引入线性化载体的末端序列，使得PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末 端一致的序列(25-40 bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在重组酶的催化下，50℃反应15 min即 可进行转化，完成定向克隆。

产品组分：

适用范围

- 快速克隆 

- 高通量克隆 

- 无缝克隆 

- 定点突变 

自备材料： 

- DNA片段； 

- 线性化载体； 

- 感受态细胞：克隆菌株制备的化学感受态细胞； 

DH5α Competent E.coli Strain常规克隆，适用于＜15 kb质粒； 

XL10 Competent E.coli Strain大片段克隆，适用于＞10 kb质粒； 

- 其他材料：ddH2O、PCR管、PCR仪等；

产品优势

1.将一个或多个插入片段定向克隆至任意载体的任意位点

2.阳性克隆比例高，阳性克隆率在90%以上

3.反应迅速，在50°C反应条件下，15min即可完成重组反应

4.颠覆传统克隆，无需酶切，一管式MIX，操作简单

保存条件

-20 ℃可以长时间存放,避免反复冻融。

操作步骤

１.在冰上配置以下反应体系：

             注：* 阳性对照含载体和2个 DNA 片段。 

                      * 每个克隆反应体系中，线性化载体和单个 DNA 片段推荐使用量各为0.1 pmol。 

                      * 若您使用未纯化的PCR产物进行重组反应，未纯化的DNA片段的体积不能超过总反应体积的10%。

‍‍2. 用移液枪轻柔地混匀反应物。 

3. 将反应管置于PCR仪中50°C孵育15 min(>6个片段的拼接,时间延长为30 min)。 

4. 吸取2 μL 的反应液转化大肠杆菌感受态细胞。推荐使用高效感受态细胞，即每1 μg pUC19 载体转化后至少能得到>2×108 转化子。 

5. 若需要进行电转，将反应液稀释5倍，再吸取1 μL 进行转化感受态细胞。 

6. 取1/10 体积的转化细胞进行涂布，若您克隆多于3个目的片段，建议您对转化后的感受态离心后再涂布。对于阳性对照反应，取1/10体积 的转化细胞涂布在含0.1 mM IPTG 的氨苄培养板上。 

7. 37°C 过夜培养。‍‍

DNA片段加入量计算

1. 每个反应中单个DNA片段的推荐使用量为0.1 pmol。 

2. 推荐DNA片段和载体的摩尔比为1:1。 

3. 当克隆片段小于200 bp时，推荐DNA片段和载体的摩尔比为5:1。 

4. 使用UV或荧光检测目的DNA片段的浓度，参考下列公式计算反应中每个DNA片段的用量。

μl of DNA fragment=

ng/μl0.65×pmol×bp

或者您还可以参考下面的表格，根据片段的长度来粗略估计相应的每个反应中DNA片段的用量(例如: 每个反应中加入0.1 pmol的DNA 片段):