活体成像研究底物之：

Firefly D-Luciferin D-虫荧光素（Luc基因）

（活体成像研究/体外生物发光研究/转录水平研究）

基本描述：

D-荧光素（D-Luciferin）是荧光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整个生物技术领域，特别是体内活体成像技术。作用机制是在ATP和荧光素酶的作用下，D-荧光素（底物）被氧化发光。当荧光素过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性（见下图）。将携带荧光素酶编码基因（Luc）的质粒转染进入细胞后，导入研究动物如大小鼠体内，之后注入荧光素，通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。也可以利用ATP对此反应体系的影响，根据生物发光强度的变化来指示能量或生命体征。

基本应用：

1）体内活体成像In vivo imaging；荧光素酶标记的肿瘤细胞、干细胞或传染疾病通常注射入研究动物模型比如大小鼠内进行研究，从而对动物模型进行实时和非侵略性的监测疾病进程和/或药效。

2）体外研究，包括荧光素酶和ATP水平分析；报告基因分析；高通量测序和各种污染检测。

常见商业化类型的差异（荧光素钾，钠，游离酸）：

目前市场上常见的有三种产品形式，D-荧光素（游离酸），D-荧光素（钠盐），和D-荧光素（钾盐）。这三种产品主要差别在于溶解特性。

1）D-荧光素（游离酸）在水以及缓冲体系内的溶解性都很弱，除非溶于弱碱如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。

2）D-荧光素（钠盐）和D-荧光素（钾盐）能够非常容易且快速的溶入水或者缓冲液中，使用方便，溶剂无毒性，特别适合体内实验。配成溶液后的三种产品，在绝大多数应用上都没有实质性的差别。

3）D-荧光素（钠盐）和D-荧光素（钾盐）基本上没有差别，主要是使用习惯等因素影响。整体来看，钾盐的应用文献明显多于钠盐。

使用方法【体内成像/腹腔注射】

一．  储存液制备（Luciferin preparation）

1.1  将D-荧光素钾盐（或D-荧光素钠盐）冻干粉回至室温，溶于DPBS（无钙/镁）使其终浓度为15mg/ml。

1.2  用0.22μm滤膜过滤除菌，条件许可现配现用。若单次实在用不完，则分装后置于≤-20℃保存，避免反复冻融。一旦使用，放到4℃解冻，保持冰冷且避光。

二．动力学曲线建立（Kinetic curve）

由于D-荧光素进入体内的生物分布非常快速且动力学具组织依赖性，因此，研究人员需正式实验前确定自身动物在D-荧光素注射后的成像采集最佳时间。通过建立动物模型的荧光素酶动力学曲线来完成。

D-荧光素给药的方式有腹腔注射（ip）、静脉注射（iv）或皮下注射（sc），通常给药方式为腹腔和静脉。以下以腹腔注射为例。

2.1 如下腹腔注射（i.p.）D-荧光素。如果给药前需麻醉小鼠，需要注意此步操作可能稍微延长动力学（荧光素酶峰值表达时间）。

2.2 a）如果在动物保持清醒时给药，等待三分钟，之后按照所选方法麻醉动物（气化或注射麻醉）。b）将麻醉后动物置于成像室内，给药后约5min开始第一次拍照。

2.3 对于腹腔注射模型，每5-10min（最长达40-60min）拍一次照以建立荧光素酶表达的动力学曲线。【大多数注射麻醉药持续20-30min，要完成一次完整的动力学研究可能需要再给一次麻醉药物。使用2%异氟烷气体麻醉健康动物能在活体成像系统如IVIS内安全放置45min。】

2.4 根据模型建立的动力学曲线选择最佳时间点采集图像。【许多模型研究表明腹腔或皮下注射后约10-20min达到信号峰值，静脉注射后约2-5min达到信号峰值。】

三．腹腔注射（i.p.）技术要点

应用示例【生物化学发光体内成像】：

Fig. 1 Image illustrates the IVIS spectrum imager and a mouse placed inside the camera box.

Fig. 2 Bioluminescence in vivo imaging. A. Representative luciferase time course (every 2 min) imaging of mice bearing subcutaneous tumors injected with luciferin. B. Graph illustrates the bioluminescence saturation of the whole mouse (displayed in A.) obtained

附录I 各种给药途径和模型动物的建议位点、针头大小和注射体积

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