植物囊泡提取纯化试剂盒（粘稠汁液植物）

产品简介：

植物囊泡在细胞间通讯、免疫调节及跨物种调控中具有重要研究价值，但其提取面临植物组织成分复杂（如多糖、酚类干扰物）和细胞壁致密的技术瓶颈，导致得率低、纯度不足。

本试剂盒专为粘稠汁液植物设计，可高效释放植物组织中的囊泡，并去除植物组织中的非囊泡成分，获得的植物囊泡可用于电镜分析、NTA粒径分析、核酸分析、蛋白分析、细胞学实验和动物实验等。

保存条件: 

Solution A -80℃保存，有效期1年，使用前4℃化冻，分装使用避免反复冻融；

其他组分常温运输保存，有效期1年。

产品组成：

* Nuclease-free, Sterile

自备材料：

一、实验材料/耗材

1、削皮刀、水果刀、玻璃砧板等（可以把待提取植物处理成方便榨汁的小块的用具）；

2、400 mL烧杯1~2个；

3、50 mL离心管、1.5mL EP管若干；

4、pH试纸，1~10（广泛），5.5~8.5（精密）。

二、实验设备

电子秤；碾磨榨汁机（推荐使用，可搜索原汁机购买）；4℃高速离心机；水浴锅；涡旋振荡器。

三、实验试剂

1×PBS溶液（无菌）

产品使用：

一、榨汁前准备

1、榨汁机消毒：将榨汁机各部件拆分开，喷洒75%酒精仔细擦拭后，放入生物安全柜紫外消毒至少20 min；

2、样品准备：按照试剂盒处理量准备待提取样品；

注：试剂盒处理量

3、样品处理：将新鲜的待提取植物洗净外表皮后，用无尘布擦干，放入生物安全柜紫外消毒至少20 min后，将植物切成方便榨汁的小块；

二、榨汁

1、榨汁机准备：在生物安全柜下，将完成消毒的榨汁机部件按照榨汁机说明书组装；

2、榨汁：将切好的植物小块投入榨汁机榨汁，质地偏硬的植物注意少量多次，收集植物汁

液，榨汁完成。

3、粘稠汁液稀释：向收集好的粘稠汁液中加PBS，边加边搅拌混匀，直至植物汁液有良好的流动性。

注：a. 如需控制内毒素，榨汁、汁液稀释过程请在生物安全柜内进行； b. 稀释所加的PBS体积需要根据榨汁后汁液的粘稠程度而定，可以少量多次加，及时搅拌观察汁液状态。

三、提取囊泡

1、植物汁液预处理：在稀释好的植物汁液中加入混匀的Solution A 试剂，添加剂量如下（其他剂量可按添加比例换算）：

注：Solution A 试剂使用前需混匀。

2、混合孵育：加入Solution A试剂后盖好管盖，颠倒混匀8~10次，将混合液37℃水浴16 h左右（过夜）；

3、调pH：将孵育好的混合液取出，在生物安全柜下用试剂盒自带的1M NaOH和1%柠檬酸将混合液pH调至7.0；

4、低速离心去杂：将调pH后的汁液于4℃，5,000 ×g，10 min离心，收集上清；

5、高速离心去杂：将低速去杂后的上清4℃，10,000 × g，20 min离心后再次收集上清；  

6、过滤：将收集到的上清依次经1 μm滤膜和0.45 μm 滤膜过滤；

注：如需获得30-1000 nm植物囊泡，可只进行1 μm 滤膜过滤，不进行0.45 μm滤膜过滤。

7、加提取试剂：取上步离心上清液加入Solution B试剂，添加剂量如下（其他剂量请等比例换算）：

8、二次混合孵育：加入Solution B后拧紧管盖，通过涡旋振荡器混匀1 min，将混合液4℃静置4 h左右；

9、沉淀植物囊泡：取孵育好的混合液，于4℃，10,000 ×g，60 min离心，弃上清，将含有沉淀的离心管再次于4℃，10,000 ×g，2 min离心后，吸尽上清；

注：沉淀中富含植物囊泡，需尽可能吸尽上清液。

10、植物囊泡重悬：取合适量的 1×PBS 均匀吹打离心沉淀，待其溶解后，将重悬液转移至新的1.5 mL EP管中（建议每20 mL植物汁液用400 μL左右1×PBS 重悬）；

11、植物囊泡收获：将含有重悬液的1.5 mL EP管于4℃，12,000 ×g 离心2 min，保留上清液，其中富含植物囊泡颗粒；

注：若沉淀较多，可12,000 ×g，2 min离心多次至无明显沉淀，每次取上清。

四、纯化和保存植物囊泡

1、纯化植物囊泡：将收获的植物囊泡颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于4℃，3,000 ×g离心10 min，离心后收集EPF柱管底的液体，此液体即为纯化后的植物囊泡颗粒；

注：a. EPF柱不可重复使用； b. 如需获得大颗粒植物囊泡，可不进行该步骤。

2、植物囊泡保存：将纯化后的植物囊泡以合适体积进行分装冻存于-80℃低温冰箱中，以备后续实验使用。

结果展示：

粒径及BCA结果展示

注意事项：

1.      试剂盒内的Solution A溶液，可以按照单次使用量分装，保存在-80℃，使用前4℃解冻，解冻后尽快用完，禁止反复冻融。

2.      Solution A 试剂静置有棕黄色沉淀，属于正常现象，使用前需混匀。

3.      若对内毒素有严格要求，榨汁步骤请严格在生物安全柜下进行，关键用品和仪器注意消毒后使用。

4.      纯化后的植物囊泡可保存在-80℃冰箱中，避免反复冻融导致植物囊泡破裂。

5.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途！

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