FastCut® EcoRI

产品简介：

FastCut®快速内切酶是一系列经过基因工程重组的快速限制性内切酶，适用于质粒 DNA、PCR 产物或基因组 DNA 等的快速酶切。所有 FastCut®快速内切酶在通用的 CutOne® 或 CutOne® Color Buffer 中都具有优良的活性，能够在 5~15 分钟内完成酶切。此外去磷酸化、连接试剂在CutOne® Buffer中均具有100% 活性，支持一管化反应，提升“酶切 - 修饰 - 连接”的体验。

CutOne® Color Buffer包括红色和黄色示踪染料，可将产物直接用于凝胶电泳。CutOne® Color Buffer 的红色染料与2500 bp 双链DNA片段在 1% 琼脂糖凝胶中迁移速率接近；黄色染料与10 bp双链DNA片段在 1% 琼脂糖凝胶中迁移速率接近。

识别位点：

GAATTC
5'...G ↓ A A T T C...3'
3'...C T T A A ↑ G...5'

同裂酶：FunII

注：同裂酶对于不同的甲基化修饰可能具有不同敏感性。

产品组成：

保存条件: 

-20℃保存，2年有效。

建议反应条件：

1× CutOne® 缓冲液；

37℃温育；

参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。

失活条件：

80℃温育20 min。

功能活性检测：

37℃下，在20 μl通用CutOne®反应体系中，1 μl FastCut® EcoRI能够在15 min内完全消化1 μg λDNA。

超长时间温育检测：

37℃下，在20 μl通用CutOne®反应体系中，将1 μl FastCut® EcoRI与1 μg λDNA共同温育3 h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解。更长时间酶切可能出现星号活性。

酶切-连接-再酶切检测：

37℃下，使用10倍酶量的FastCut® EcoRI消化DNA底物，回收酶切产物，在22℃下使用T4 DNA Ligase (Fast)可以将超过95%的酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开约95%以上的连接产物。

非特异性内切酶活性检测：

37℃下，在20 μl通用CutOne®反应体系中将1 μl FastCut® EcoRI与 1 μg超螺旋质粒DNA共同温育4 h后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于10%的质粒DNA转变成缺刻或线性状态。

蓝白斑检测：

使用1 μl FastCut® EcoRI消化含有lacZα 基因且仅在该基因上具有1个酶切位点的特定载体。将酶切产物重新连接后转化到大肠杆 菌感受态细胞中，涂布在含有X-gal、IPTG和相应抗生素的LB平板培养基上生长。成功连接的β-半乳糖苷酶基因可以正确表达，并生长出蓝色菌落；而因酶切末端降解等原因未能重新连接的产物将得到白色菌落。对于FastCut®系列限制酶而言，白色菌落的比例应当小于 1%。

使用方法：

1. DNA快速酶切流程

① 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：

a.本体系适用于经过纯化的PCR产物酶切。未纯化的PCR产物具备一定的离子强度，10× CutOne® Buffer 加入量可适当减少至2 μl。但由于DNA聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对PCR产物进行纯化。

② 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；

③ 37℃温育15 min（质粒），或15~30 min（PCR产物），或30~60 min（基因组DNA）； ④ 80℃温育20 min即可使酶失活，停止反应（可选）；

⑤ 如果使用CutOne® Color Buffer进行酶切反应，得到的产物可以直接进行上样电泳。

2. 双酶切或多酶切

① 每种快速内切酶的用量为1 μl，并根据需要适当扩大反应体系；

② 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的1/10；

③ 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同，应先以最适温度低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，在其最适反应温度下进行酶切反应。

3. 适用于质粒的扩大反应体系

注：如果总反应体系大于20 μl，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。

不同DNA中的酶切位点数量

甲基化修饰影响

在不同反应缓冲液中的活性

注：活性数据来自限制酶标准反应体系下的检测。

注意事项：

1.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。