rProtein A/G MagPoly Beads

产品介绍

rProtein A/G MagPoly Beads（蛋白 A/G聚合物磁性微球）是 rProtein A/G高密度定向包被到超顺磁性聚合物微球表面，该产品具有更高的 抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率 ，一步纯化即可从血清样品中分离出纯度大于 90%的抗体。产品性能见表 1；用户可根据目标抗 体的种属来源及亚型选择微球的类别 ，Protein A ，Protein G和 Protein A/G与不同抗体的亲和性比较参见附表。

表1.rProtein A/G MagPoly Beads产品性能

操作步骤

本操作流程主要为免疫沉淀反应，每次反应使用 50μl rProtein A/G MagPoly Beads为例，可根据需要适当的增加或减少磁珠使用量。

1 缓冲液的准备

 所用水和缓冲液在使用之前建议用 0.22μm或 0.45μm滤膜过滤。

裂解缓冲液：50mM Tris-HCl ，0. 15M NaCl ，1% IGEPAL-CA630 ，1mM PMSF ，pH7.4 

平衡/洗杂液：0. 15M NaCl ，20mM Na2HPO4 ，pH7.0 

洗脱液：0. 1M 甘氨酸 ，pH3.0 

中和液：1M Tris-HCl ，pH8.5 

交联液：0.2M三乙醇胺 ，pH8.2 

交联剂：DMP（dimetylpimelimidate dihydrochloride） 

终止液：50mM Tris-HCl ，pH7.5

2 样品准备 

方案 I: 贴壁细胞的裂解 

1) 小心去除单层细胞的培养基。 

2) 用预冷PBS清洗细胞两次。 

3) 根据表2的推荐体积向细胞中加入预冷裂解缓冲液。冰上孵育 5 min，期间混匀几次。 

4) 将上述裂解好的样品转移至一个新的离心管中，约13,000 ×g 离心10 min，分离细胞碎片。 

5) 将上清转移到一个新管中，进行蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。

表2.针对各种标准培养皿的裂解缓冲液的推荐使用体积

方案 II：悬浮培养细胞的裂解

1) 将细胞悬液以 1,000×g离心 5 min，收集细胞，弃上清。

2) 用预冷 PBS将细胞团轻轻重悬，将细胞悬液以 1,000×g离心 5 min，收集细胞，弃上清。

3) 向细胞团块中加入预冷裂解缓冲液。每 50mg细胞团块使用 500 μl。

4) 将上述裂解好的样品在冰上孵育 5 min，期间混匀几次。13,000×g离心 10 min，去除细胞碎片。

5) 将上清转移到一个新管中，备蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。

3 磁珠准备

1)将 rProtein A/G MagPoly Beads颠倒或漩涡混合均匀。

2)取 50μl rProtein A/G MagPoly Beads加入新的离心管中。放置在磁分离器上 ，待溶液变澄清后 ，用移液器吸弃保护液。

3)将离心管从磁分离器上取下来，加入 200μl平衡液，混匀，放置在磁分离器上 ，收集磁珠，用移液器吸弃保护液。重复洗 2次。

4 抗体吸附

1) 加入抗体溶液（5-25μg抗体总量） ，充分混匀 ，体积不足 500μl时用平衡液补足。

2) 室温孵育 10min以上（具体时间根据结合效果调整） ，可以振荡或漩涡混合均匀。

3) 将离心管置于磁分离器上 ，待磁珠全部吸附后 ，吸弃上清液。如需要可留做进一步检测。

4) 加入500μl洗杂液混合均匀 ，置于磁分离器上 ，待磁珠全部吸附后 ，吸弃上清液。重复洗杂至少 3次。

5 抗体交联（备选）

1) 如果需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱 ，请忽略本步骤 ，直接进行操作6。

2) 加入 1ml交联液 ，振荡悬浮 ，置于磁分离器上 ，大约 1min ，待溶液变澄清后 ，吸弃上清液。该操作重复两次。

3) 再加入 1ml含有 20mM DMP（dimetylpimelimidate dihydrochloride）的交联液 ，此试剂需要现用现配。振荡悬浮，在室温下置于翻转混 合仪或者手工轻轻翻转离心管 ，促使溶液和磁珠充分接触 ，约 30min后 ，置于磁分离器上 ，大约 1min ，待溶液变澄清后 ，吸弃上清液。

4) 使用 1ml终止液悬浮磁珠 ，终止交联反应 ，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管 ，促使溶液和磁珠充分接触 ，约 15min后 ， 置于磁分离器上 ，大约 1min ，待溶液变澄清后 ，吸弃上清液。

5) 加入 1ml平衡液 ，颠倒混匀 ，置于磁分离器上 ，大约 1min ，待溶液变澄清后 ，吸弃上清液。再重复两次。

6 抗原结合反应

1) 加入含有抗原的细胞裂解样品（步骤 2，通常 100-1000μl)，用移液器轻轻吹打使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散。

2) 在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管 10min，使抗原与抗体充分结合，如结合力较弱则可在室温下反应 1h或者在 4℃下反应 过夜。

3) 上述完成抗原吸附的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离 ，收集上清液 ，以备后续检测。

4) 向离心管中加入 1ml洗杂液 ，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散 ，然后进行磁性分离 ，弃上清液；从磁分离器上取下离心管 ，再重复洗涤两次。

7 抗原洗脱

方案一 变性洗脱

此方法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE检测。

1) 从磁分离器上取下离心管 ，向其中加入 25μl 1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀 ，95℃加热10min。

2) 置于磁性分离器上 ，进行磁性分离 ，或者离心 ，收集上清液进行SDS-PAGE检测。

方案二 非变性洗脱

1) 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入 300μl洗脱液 ，混合均匀 ，室温孵育 10min。

2) 置于磁性分离器上 ，进行磁性分离 ，吸取上清为洗脱液至新的离心管中。

3) 重复步骤 1）和 2）两次 ，收集洗脱液 ，与 2）收集洗脱液混合 ，加入中和液中和至pH7.0-8.0。

*附表. Protein A、 Protein G 和 Protein A/G 对不同抗体的结合能力

++++：结合能力强；++：结合能力中等；—：结合能力弱或没有结合。