Magneti-G RFP 标签免疫沉淀免疫共沉淀试剂盒

产品介绍 

1 Magneti-G商标 

Magneti-G商标来自于磁性（Magnetic）的英文谐音，G为高聚物的汉语拼音的首字母，因此本公司带有这一商标的产品，均为高聚物材质的磁性微 球。这一商标主要用于一系列基于抗体亲和方法的标签蛋白IP试剂盒，目前已有Anti-His-tag、Anti-Myc-tag、Anti-HA-tag、Anti-DYKDDDDK-tag、 Anti-GFP-tag和Anti-RFP-tag六种标签IP试剂盒。 

2 RFP标签 

红色荧光蛋白基因是从海葵中分离出的一种红色荧光蛋白基因，其蛋白质的最大吸收光谱为583nm，不需要任何预处理便可检测到，通过重组DNA 技术将RFP标签融合到目的蛋白的C端或N端后，可以检测其融合表达蛋白的表达、定位纯化，该系统已广泛应用于各种细胞类型，包括细菌、酵 母和哺乳动物细胞等。 

3 Anti-RFP抗体 

Anti-RFP抗体可以用于检测和RFP标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，也可以用于RFP融合表达蛋白的纯化、定性或定量检测。本公司的 Anti-RFP亲和力较高，适合做WB、IP等蛋白互作实验。 

4 磁珠性质 

高聚物磁珠采用高分子聚合技术将超顺磁性材料和高分子材料完美地结合在一起，具有更快的磁响应性同时保持微球良好的分散性、极低的非特异性 吸附和更丰富的结合位点。磁珠具体性能见表1。 

表1：Magneti-GAnti-RFPBeads产品性能

5 试剂盒组分 

本产品适用于原核和真核细胞裂解物或者培养上清中分泌表达的RFP标签蛋白的IP、Co-IP等蛋白质相互作用实验，具体组分见表2。

表2：试剂盒组份

使用方法

1 缓冲液配制

1)  1×Lysis Buffer(A+B)配置：使用前将IP Lysis Buffer A（5×）用ddH₂O稀释成1×IP Lysis Buffer A，并补加终浓度为0.1%的IP Lysis Buffer B（1ml 1×IP Lysis Buffer A中加1ul IP Lysis Bufer B），标记为1×Lysis Buffer（A+B）备用。稀释后的缓冲液建议4℃保存； 

2）1×IP Wash Buffer配置：将IP Wash Buffer（10×）用ddH2O稀释10倍使用。如：配置10ml1×IP Wash Buffer，具体操作为取1ml IP Wash Buffer， 加入9ml ddH₂O，充分混匀标记为1×IP Wash Buffer即可使用。实验未用完的1×IP Wash Buffer可稳定保存在2-8℃3个月，保存时间过久易 长菌。 

3) PBS为自备试剂。

2 样品前处理 

A 悬浮细胞样品裂解 

1) 1000×g室温离心5min，弃上清，收集细胞； 

2) 用适量PBS将细胞团轻轻重悬，将细胞悬液以1000×g离心5min ，弃上清，收集细胞。重复三次； 

3）向细胞团块中加入预冷1×Lysis Buffer (A+B)，每1×106-5×106cels使用1000ul。 

4）将上述加了1×Lysis Buffer（A+B）的样品上下颠倒混匀5-10次，随后置于冰上裂解5-10min，期间混匀2-3次。 

5）13,000×g 离心10min，去除细胞碎片。 

6）将上清转移至新的离心管中，标记为细胞裂解样品。 

B 贴壁细胞样品裂解 

1) 小心除去单层细胞的培养基 

2) 用适量预冷的PBS细胞清洗三次。 

3）根据表3中推荐体积将1×IP Lysis Buffer（A+B）慢慢滴加至细胞孔板中，滴加时尽量覆盖整个平皿，随后置于冰上裂解5-10min，期间混匀 2-3次。 

4）将上述裂解好的样品转移至新的离心管中，约13,000×g 离心10min，去除细胞碎片。 

5）将上清转移至新的离心管中，标记为细胞裂解样品。 

表3.1×IP Lysis Buffer（A+B）推荐体积

C 注意事项 

真核表达的分泌蛋白可直接取培养上清离心。真核表达的胞内蛋白先用1×PBS（pH=7.4）清洗3-5次，随后用裂解液裂解细胞后离心取上清，再进 行后续步骤。核酸是强电性物质，如果核酸吸附到磁珠上，最终将造成杂蛋白变多。除去核酸有两个常用的方法： 

1) 充分超声可以打断核酸，但过度超声也7会造成蛋白降解。 

2) 使用伯仪生物超级核酸酶(SLP008)消化，这一方法需要注意缓冲液的选择。低浓度非离子型表面活性剂，如吐温-20、曲拉通-100可以帮助分 散脂类团块，有助于获得更纯的目的蛋白。

3 磁珠漂洗 

1) 将磁珠充分混匀后取20ul磁珠置于离心管中，向管中加入500ul1×IP Wash Buffer，上下颠倒混匀5-10次。 

2) 将离心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。 

3) 向管中加入500ul1×IP Wash Buffer，上下颠倒混匀5-10次，将离心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。

4) 重复操作3次。

5) 注：本试剂盒中提供适量阴性对照（Magneti-G Control IgG Beads），免疫沉淀实验时建议设置阴性对照组。使用方法与Magneti-G Anti-RFP Beads完全一致。若有更多需求，可以订购本公司的Magneti-G Control IgG Beads(货号：MP5801) 

4 样品孵育

1) 向上述漂洗好的磁珠中加入500-1000ul的细胞裂解样品，常温或4℃下孵育60min（建议在旋转混匀仪上孵育，使样品和磁珠充分接触）。

2) 孵育结束后，将离心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，将上清转移至新的离心管中，留样备检。

3) 向离心管中加入500ul1×IPWashBuffer，轻轻颠倒混匀5-10次后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后弃去上清。

4) 重复操作5次。

注：孵育温度和时间范围推荐为：室温0.5h-2h或者4℃、1h-4h，根据实际的结合效果适当调整孵育时间，不建议过夜孵育，过夜孵育可能会引起 过多的非特异性吸附。磁珠每次洗涤，加入IP Wash Buffer后可以冰上静置3-5分钟。

5 蛋白洗脱 

1) 洗脱液洗脱 每20ul原始磁珠体积加入40ul洗脱液，常温或4℃洗脱5-10min，期间轻轻混匀3-5次。孵育结束后将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸 取上清至新的离心管中，进行Western检测。 注：Elution Buffer D可以充分洗脱标签蛋白，且能保证磁珠上的抗体只有很少量的脱落，但是磁珠上可能有少量目的蛋白残留。 

2) SDS-PAGE上样缓冲液洗脱 每20ul原始磁珠体积加入30ul的PBS（自备）重悬磁珠，再加入30ul的2×SDS Loading Buffer，轻摇摇晃混匀后95-100℃高温处理5-10min。将 离心管置于磁力架上分离10s，取上清进行SDS-PAGE电泳或进行Western检测。 

注：SDS-PAGE上样缓冲液洗脱会使目的蛋白能够完全从磁珠上脱离，但是抗体也会完全脱落。磁珠上Anti-RFP抗体为人源化抗体，后续WB实验建议选择鼠抗。Western检测的上样量建议控制在20ul以内，剩余的样本可冻存于-20℃保存。

注意事项 

1) 本产品保存在2-8℃，不可冻结保存； 

2) 本产品出现轻微团聚属正常现象，可正常使用； 

3) 本产品不要使用含有DTT等还原剂的细胞裂解液样品，DTT可能会导致抗体配体的脱落； 

4) 本产品能耐受≤2M尿素，高浓度的尿素会导致抗体配体脱落； 

5) 在清洗和洗脱时避免吸取到磁珠，清洗时吸取到磁珠会影响最终的载量，洗脱时吸取到磁珠会影响目的蛋白的质量和电泳效果，第一次洗脱后 可以将洗脱液置于新的离心管中，再次置于磁力架上进行吸附。

参考信息 

1) RFP tag IP实验：样品为胞内表达蛋白，含有His和RFP标签。 

2) 取0.5ml悬浮细胞（≈1.5×106个）常温下1×PBS（pH=7.4）清洗三次后快速进行裂解、离心；

3) 加入20μl已经清洗过的磁珠于离心后的上清中摇晃孵育30min；

4) 将含有磁珠的样品管转移到磁力架上，分离磁珠和液体，用移液器吸走上清，留下磁珠；

5) 用IP Wash bufer清洗5次后加入2×SDS Loading Buffer 99℃ 高温处理10min后进行WB；

6) 检测抗体为Anti His-HRP mAb，阴性对照(-)为不带RFP抗体的磁珠和样本孵育。

常见问题与解答 

聚合物磁珠和琼脂糖磁珠有何区别？ 

1) 琼脂糖磁珠是带孔微球，粒径在30-100μm，交联时会有一部分配体会进入球孔内部，所以偶联载量相对较高，适用于蛋白的快速纯化；而聚 合物磁珠通常粒径为1-3μm以下，配体主要分布在微球表面，这种类型的磁珠能够快速结合蛋白，空间位阻影响小，适用于蛋白互作实验，但 其载量不高； 

2) 推荐使用琼脂糖磁珠进行蛋白纯化实验，使用聚合物磁珠进行蛋白互作实验如IP、Co-IP和pull down实验等。 

为何结合不到目的蛋白？ 

1)  可能是由于蛋白无表达造成的，建议在纯化前用WB检测下蛋白原始表达量，如果WB无信号，目的蛋白很难捕获； 

2) 样本中有高浓度的还原剂等干扰物质，建议选用合适的裂解液。