外泌体快速纯化试剂盒

产品介绍

1 产品描述
本试剂盒通过束缚水分子使溶解度较低的外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）等细胞膜囊泡析出，随后可通过短时间的低速离心来收集这些难 溶组分。另外本试剂盒通过一系列的配方优化，提高了外泌体的回收率，适用于下游的细胞共培养、电镜分析、Western Blot、荧光定量 （qPCR）和高通量测序等应用。

2 外泌体功能介绍
外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）属于细胞膜囊泡，包含蛋白，mRNA，microRNA，DNA和脂类。外泌体直径 30-150nm，多种细胞在正常及病 理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，且外 泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体具有多种多样的功能，其功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与 到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等。

3 外泌体的形成过程
膜双层通过磷脂的不对称分布来维持脂质的“多面性”。外膜富含磷脂酰胆碱和鞘磷脂，而内膜主要由磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)和磷脂酰乙醇胺形成。微泡由质膜出芽形成，主要原因是由于 Ca2+通过磷脂双分子层破坏了膜的不对称性，导致磷脂跨膜双层的重新分配， 促进膜起泡，最终导致出芽过程的进行，出芽形成芽泡，将泡体中的外泌体释放到细胞外，这样就形成了一个完整的外泌体。

4 试剂盒组份
该试剂盒主要包括两种试剂，具体见下表：

表1：试剂盒组分

5 样本选择
外泌体快速纯化试剂盒适用于多种样本的外泌体提取与纯化，我们测试过培养基上清、血清、血浆以及尿液样本，都能够满足下游检测和鉴定需求，但植物外泌体没有进行测试，客户如有需求可自行检测。

使用方法
1 样品预处理
取待纯化的样品进行差速离心，首先用300g离心10min，继续收集上清，再用2000g离心10min，最后用10000g再离心10min，将收集的上清用0.22μm的滤膜进行过滤处理（可选）。

2 样品中外泌体提取
将上一步收集的滤液样本与 QE-Buffer A按 2:1混合（50ml的样本加入 25ml的 QE-Buffer A），充分混匀后 4℃过夜孵育，注意混匀后最好是 静置孵育过夜，不要在混合器上旋转。

3 外泌体浓缩富集
将孵育后的混合液在 4℃下 12000 rpm离心1h，用一定体积的 QE-Buffer B重悬沉淀（50ml的样本加1ml QE-Buffer B重悬），也可根据沉淀 的量调整 QE-Buffer B的重悬体积，用移液器轻轻吹打混匀后，在室温放置 30min可充分溶解。

4 外泌体保存与应用
将收集的外泌体溶液保存于-20℃或-80℃冰箱中，尽量避免反复冻融，可分装以备下游检测和应用。如需无菌培养，可使用 0.22 μm无菌过滤 器进行过滤收集。

注意事项
1) 本试剂盒无菌无热源，请在洁净环境下使用；
2) 所有试剂在低温中取用，所有操作尽量在低温环境下进行，这样可以更好的保持外泌体的完整性；
3) 外泌体较脆弱，建议尽量在低温下进行操作，防止外泌体活性受损，影响下游实验；
4) 提取的外泌体保存在-20℃或-80℃中，可保存半年时间，外泌体分装使用，尽量避免反复冻融。

参考信息
293细胞外泌体纯化：
1) 取 50ml培养基上清，差速离心去除颗粒沉淀，加入25 ml的 QE-Buffer A溶液；
2) 混匀后，静置于 4℃过夜孵育；
3) 4℃，12000 rpm离心 1 h回收沉淀，并使用 1ml QE-Buffer B溶液重悬沉淀；
4) 对洗脱产物进行标志物蛋白的 WB检测、纳米流式检测以及电镜检测，

常见问题与解答

1 如何快速鉴定纯化后的产物是否含有外泌体？
1) 直接裂解洗脱样本，通过吸光值、BCA或者Bradford检测下蛋白浓度，通常外泌体的获取量和蛋白浓度呈现正相关；
2) 外泌体检测最直接的方式是仍然是 WB检测，外泌体的几个特征性标志物 CD9、CD63、CD81、TSG101和 HSP70等，通常 WB选用 2-3个 特异性蛋白进行WB检测可初步判断样品中是否含有外泌体。

2 为何洗脱后的样本中不含有外泌体或含量低于正常值？
1) 可能是样本中所产生的外泌体较少，适当扩大预处理的样本容量，并排除培养过程中因活率过低或其它原因导致的外泌体污染；
2) 虽然看不见但可以结合下游实际需求进一步分析，可组合其它的检测方法如 WB、纳米流式等进行辅助验证；
3) 在实际提取分离过程中是否严格按照说明书要求进行分离纯化，排除是否因操作不当造成样本的流失；
4) 根据所提取样本的特性而定，提取本试剂盒推荐来源以外的外泌体时，并不能够保证提取效率与从 293细胞培养基上清中提取效率相当,但仍需尽可能保证 4℃的条件下进行,排除外泌体降解的可能以及样本来源差异。

3 如何长时间保存外泌体洗脱液？
1) 外泌体会降解不推荐长时间保存，如果不得以需要长期储存，建议在-20℃或-80℃下保存最长不超过 30天，若在 4℃下储存最长不超过 7 天；
2) 注意分装，避免反复冻融。

4 外泌体分离方法哪种方式最好？
1) 没有最好的方法，主要根据实验需求而定，本款试剂盒的最大特点就是比传统的超速离心法更快，且对设备的依赖性更低；
2) 有条件的情况下可以尝试多种方式组合提取。

保存与运输
运输：冰袋运输，不可冻结。
保存：2-8 ℃冷藏保存，不可冻结。