BCA Protein Assay Kit

产品介绍

BCA（Bicinchoninic acid）法是目前世界上最常用的两种蛋白浓度检测方法之一。BCA蛋白质定量包括两步反应：首先，二价铜离子(Cu2+)在碱性条件下被蛋白质的肽键还原成一价铜离子(Cu+)；其次，两个分子的 BCA络合一个一价铜离子(Cu+)，形成一种在 562 nm处有强吸 收值的紫色复合物，而复合物的吸收值与蛋白的浓度在一定范围内呈线性相关。

使用 BCA法进行蛋白质定量有以下特点： 

1 不受蛋白种类的影响，在 20-2000 μg/mL浓度范围内有较好的线性。

2 表面活性剂对浓度检测的干扰较小。但由于还原剂和螯合剂对反应有阻碍，因此本制品不适用于含有还原剂或者螯合剂的蛋白质样品的定量。

表1是试剂盒的基本组成，我们提供两种检测方案：试管和微孔板。试管方案所需样品量较大(0.1 mL),但样品和工作液的稀释比例为1:20（V/V），所以干扰物的影响比较小；微孔板方案所需的工作液较少(200 μL)，样品体积少(25 μL)，但样品和工作液的稀释比例为 1:8(V/V)， 对干扰物的耐受较差。

表 1. BCA Protein Assay Kit组成

操作步骤

1 BSA标准品稀释梯度

按照表 2制备一组蛋白质标准品。最好使用与待测样品相同的稀释液，每个稀释浓度的标准品的体积足够用于三次重复检测。

 用于标准方案的稀释方法（检测范围=20-2000 μg/mL）

用于试管增强方案的稀释方法（检测范围=5-250 μg/mL）

表2.稀释牛血清蛋白（BSA）标准品

2 制备 BCA工作液

1) 使用下述公式来确定所需的工作液的总体积:（标准品的个数+待测蛋白质样品的个数）×（实验重复次数）×（用于每个样品的工作液的体积）=所需工作液总体积

2) 将 50份 Solution A与1份 Solution B混合（A:B=50:1），制备工作液。

3 试管方案（样品与工作液的比例=1:20）

1) 取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各 0.1 mL，加入到做好标记的试管中。

2) 在每个试管中加入 2.0 mL工作液，充分混合。

3) 将试管密封，根据不同实验方案，选择相应的温度和时间进行孵育：

标准方案：37℃，30 min

增强方案：60℃，30 min

4) 将所有试管冷却至室温。

5) 将分光光度计波长设定在 562 nm，用 I管空白标准品对仪器进行调零（增强方案用 F管空白标准品对仪器进行调零），然后在 10 min内依次检测所有样品的吸光值。

6) 将 BSA标准品在 562 nm处经过空白校正的吸光值对其浓度（μg/mL）作图，绘制标准曲线。使用该标准曲线来确定每个待测蛋白质样 品的浓度。

4 微孔板方案（样品与工作液比例=1:8）

1) 取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各 25 μL，加入到微孔板中。

2) 在每一个孔中加入200 μL工作液，并在震荡器上震荡 30 s，使其充分混合。

3) 将微孔板密封，在 37℃孵育 30 min。

4) 将微孔板冷却至室温，使用酶标仪测量样品在 562 nm处的吸光值。

5) 将各个标准品和待测蛋白质样品在 562 nm处的吸光值减去空白标准品在 562 nm处的平均吸光值。

6) 将 BSA标准品在 562 nm处经过空白校正的平均吸光值对其浓度（μg/mL）作图，绘制标准曲线。使用该标准曲线来确定每个待测蛋白 质样品的浓度。

5 注意事项

1) 当 Solution B加入到 Solution A中时，开始可观察到有浑浊产生，搅拌后浑浊迅速消失，得到果绿色的澄清工作液。根据所要检测的样 品数量，配制足够体积的工作液。配制好的工作液在室温密闭容器中可稳定保存 24 h。

2) 该方法不是终点法，孵育完成后，工作液和待测样品混合液仍会继续显色，但室温的显色速率较慢，请在 10 min内完成所有样品检测， 就不会产生明显误差。

3) 标准方案检测时，如实验条件限制无法进行 37℃孵育，也可选择室温孵育 2 h。

4) 延长孵育时间或者升高温度会使工作液与待测样品反应颜色变深，在 562 nm处吸收值变高，影响读数的准确性，降低试剂的检测灵敏 度。

5) 增强方案操作不建议在微孔板中进行，因微孔板中样品量较少，加热过程中易挥发，影响检测准确度。

6) BCA试剂盒对各试剂的耐受浓度，请咨询 ACE的技术支持。

7) 不同蛋白用 BCA试剂盒检测，都会有独特的吸光度反应。通常使用 BSA作为标准定量未知蛋白的浓度，但如果需要精确定量，请使用高纯度目的蛋白做标准品。其他蛋白相对 BSA的吸光度系数，请咨询技术支持。